De stora bäckenganglier innehåller parasympatiska och sympatiska nervceller som innervate bäckenorganen. Här beskriver vi en dissekeringsmetod och ger scheman för identifiering av dessa ganglier och deras tillhörande nerver. Dessa metoder kan tillämpas på experimentell manipulation av dessa ganglier in vivo eller avlägsnande post-mortem för vidare studier.
De bilaterala stora bäckenganglier (MPG; synonym, bäckenhålorna ganglier) är den primära källan till postganglionic sympatiska och parasympatiska nervceller innervating bäckenorgan gnagare; den funktionellt likvärdiga strukturen hos människor är den sämre hypogastric plexus. De stora bäckenganglierna ger också den väg genom vilken ländryggar och sakrala sensoriska axoner når bäckenorganen. Dessa komplexa, blandade ganglier kan visa sig utmanande att identifiera och dissekera för ytterligare experimentell studie av normala autonoma mekanismer eller att upprätta prekliniska modeller av sjukdom, skada eller visceral smärta. Här beskriver vi ett protokoll för att komma åt och visualisera dessa ganglier och deras tillhörande nervområden. Vi förser detta protokoll med scheman för både manliga och kvinnliga råttor, eftersom ganglion storlek och landmärken för identifiering skiljer sig mellan könen. Protokollet beskriver avlägsnandeav ganglion för in vitro-studier, men denna metod kan integreras i ett kirurgiskt återhämtningsprotokoll för experimentella interventioner (t.ex. nervkrossa, nervsamband) eller för kartläggning av neuronala kretsar (t.ex. genom mikroinjektion neurala spårämnen). Vi visar också de primära strukturerna i ganglion och dess associerade nerver omedelbart efter dissekering och efter immunohistochemical färgning.
Råttan är en av de bäst karakteriserade arter som används i studien av bäckenorganens fysiologi och anatomi. Medan utmärkta resurser finns för beskrivningar av dessa organ1,2, de i allmänhet inte ger information om relaterade neurala strukturer eller göra det med otillräcklig upplösning för att vägleda en experimentell studie. Som beskrivs längre nedan, organisationen av autonoma ganglier som reglerar bäckenorganenfunktion är helt annorlunda än resten av det autonoma nervsystemet, vilket gör det svårt att exakt dra slutsatsen bäckenhålorna innervation funktioner från neuroanatomisk information tillgänglig för andra autonoma ganglier. Denna brist på resurser för att vägleda forskare in i detta område kan ha bromsat forskning om neural reglering av bäckenorganen. Här beskriver vi protokoll för att komma åt denna region i nervsystemet för ytterligare in vitro-studier eller experimentellintervention.
De bilaterala stora bäckenganglier (MPG; synonymer: bäckenhålorna, paracervical ganglier [kvinna]; Frankenhäusers ganglion [hona]) är den primära källan till postganglionic sympatiska och parasympatiska nervceller innervating bäckenorgan av gnagare; den sämre hypogastric plexus omfattar motsvarande neuronal struktur hos människor3,4,5,6. Sensoriska projektioner från ländryggen och sakrala dorsala rotganglier reser också via MPG för att nå bäckenorganen. Därför är förståelse av MPG:s neurala kretsar och biologi avgörande för prekliniska studier på en myriad av kliniska tillstånd som rör bäckenorganens utveckling och vuxna funktion. Flera utmärkta beskrivningar av gnagare MPG har publicerats7,8, men vår erfarenhet är att i allmänhet dessa beskrivningar inte alltid ger tillräcklig vägledning för att praktiskt informera en experimentell dissekering eller manipulation av dessa strukturer när återvinning av djuret krävs. Dessutom fokuserar majoriteten av MPG-studier på hanråttor. Hos kvinnliga råttor är MPG mindre9 och har distinkta anatomiska landmärken, och kräver därför en tydligt skräddarsydd guide till visualisering och dissekering.
Sympatiska och parasympatiska vägar kännetecknas av deras anatomi, särskilt platsen för deras preganglionic nervceller, med sympatiska vägar med preganglionic nervceller i thoraco-ländryggen ryggmärgen och den parasympatiska preganglionic nervceller ligger i hjärnstammen (kranialnervprognoser) och sakral ryggmärg. I de flesta andra regioner i det autonoma systemet, deras mål ganglion nervceller ligger i olika sympatiska eller parasympatiska ganglier. Men MPG är ovanliga i att vara blandade sympatisk-parasympatiska ganglier, och därför på makroskopiska skala är platser för konvergens från preganglionic axons av både thoraco-ländryggoch sakrala spinal regioner. Vi har därför inkluderat i våra protokoll platsen och beskrivningen av dessa primära nervskrifter som förbinder varje spinal region med MPG, underlätta experimentell analys eller separat manipulation av dessa neurala komponenter. Vi noterar också för läsare som specifikt jämför dessa ganglier mellan arter, att hos gnagare är spinal preganglionic nervceller som är “funktionellt sakrala”, t.ex. likaså L6 och S1 dorsala rot ganglier ger de stora “sakrala” sensoriska ingången till bäckenorganen. Hos gnagare är sensorisk och preganglionic ingång från mer rostrala neurala kretsar koncentrerad till spinalnivåer L1 och L210.
Här beskriver vi ett protokoll för att komma åt MPG och deras tillhörande nervskrifter hos manliga och kvinnliga råttor, och stödja detta med scheman för att illustrera specifika landmärken. Detta protokoll styr kirurgisk tillgång till dessa strukturer i ett experimentellt sammanhang för att ta bort vävnaden för in vitro-studier, t.ex. Det kan också anpassas till MPG borttagning efter intracardiac perfusion med fixativ, även om detta är en svårare dissekering eftersom den neurala vävnaden blir svårare att visualisera när de intilliggande vävnaderna saknar blod. Detta protokoll kan också integreras i en kirurgisk inställning för experimentell intervention av dessa nervvägar (t.ex. nervsamband, mikroinjektion av neurala spårämnen). Dessa typer av dissektioner blir allt viktigare för det växande området bioelektronisk medicin, där nya mål och metoder för neuromodulering för behandling av kliniska tillstånd i bäckenhålorna håller på att utvecklas11. Vi presenterar hela protokollet först för hanråttor, sedan en kopia av protokollet skräddarsydd speciellt för kvinnliga råttor.
Neural kontroll av bäckenorganen medieras av komplexa vägar inklusive somatiska, parasympatiska, sympatiska och viscerala sensoriska komponenter14,15,16,17. De flesta av dessa vägar har sitt ursprung i eller passerar genom MPG. Dissekeringsprotokollen som beskrivs här ger en introduktion till MPG-anatomi, tillhörande nerver och närliggande makroskopiska anatomiska landmärken; de senare illustreras av anatomiska scheman. Andra metoder för MPG-dissekering kan också vara framgångsrika, men vi tycker att den som beskrivs här är robust och lämplig för en forskare som är ny på detta område av nervsystemet.
De mest kritiska aspekterna av protokollet är korrekt identifiering av varje större nerv och fullständigt avlägsnande av MPG-vävnad. Med noggrann visning och hantering av vävnaderna kan MPG-vävnader tas bort för anatomiska, molekylära och elektrofysiologiska in vitro-studier18,19,20,21,22. Protokollet kan också anpassas för in vivo experimentell manipulation23,24,25, notera att i detta fall måste stor försiktighet iakttas för att minimera kontakten med de primära nerverna i samband med ganglion eller skada närliggande vasculature. Om experimentet kräver selektiv denervation genom avbrott av en eller flera nerver, rekommenderas att ligate avhuggna nerv för att förhindra återinnersvation och förvirrande analyser. Detta dissekeringsprotokoll kan också användas för musen, där det också finns en MPG med jämförbar funktion26,27,28.
För neuroanatomiska studier erhålls det bästa bevarandet av antigener och vävnadsstruktur genom att dissekera MPG från ett bedövningsmedel som har perfunderas transkardialt med histologiska fixativ som är lämpligt för experimentet29; identifiering av ganglion och nervstrukturer är dock svårare efter denna process, eftersom vävnaden färgning går förlorad. Det rekommenderas att bli skickliga på att identifiera och dissekera ganglion från nonperfused djur innan du försöker detta dissekering efter perfusion. Likaså rekommenderas att först bli skickliga i dissekering hos män eftersom för djur med motsvarande ålder och kroppsstorlek, MPG och dess tillhörande nerver är mycket mindre hos kvinnor.
För att validera att vävnaden tas bort är verkligen MPG, är forskaren först rekommenderas att kontrollera platsen och funktionerna i varje primär nerv. Många dissectors hitta bäckennerven och cavernous nerv det enklaste att identifiera på plats; hypogastrisk och tillbehör nerver är mer känsliga och svårare att skilja från den omgivande vävnaden. Om dessa nerver inte längre är tillgängliga på grund av problem under dissekering, eller om det finns osäkerhet om deras struktur, rekommenderas att inledande MPG-dissektioner kännetecknas av konventionell histologi (för att bekräfta förekomsten av neuronala cellkroppar8) och för det andra med immunohistokemi (för att identifiera att både kolinerga och noradrenergic nervceller finns30,31) (Figur 3). För att validera korrekt identifiering av de stora nerverna identifieras de cavernösa nerverna lätt genom sin höga densitet av neuronala cellkroppar i sin ursprungliga del nära MPG; de flesta av dessa nervceller uttrycka markörer för kolinerga, nitrergic nervceller32,33. Bäcken- och tarmnerverna har väldigt få neuronala cellkroppar34.
Det finns flera vanliga fallgropar i utförandet av denna dissekering. Om nybörjare dissektorer har problem att hitta någon av de stora nervereller MPG, de uppmuntras att återgå till de steg som beskriver de viktigaste landmärken. Det är mycket vanligt att bli så fokuserad på att hitta mikrostrukturer att man förlorar reda på makroskopiska sammanhang. Oftast, nybörjare dissektorer antingen flytta för långt rostral i deras dissekering webbplats eller förbli för “ytliga”-dvs. för nära den ventrala öppnandet av buken, snarare än att undersöka djupare (dvs. mer dorsala) strukturer. Ett vanligt problem under dissekering är skador på vaskulaturen under dissekering. Om blödningen börjar, håll försiktigt en bomullstippad applikator över källan tills blödningen upphör, sedan spola området frikostigt med saline innan du kommer tillbaka dissekering. Det är möjligt mpg inte kommer att kunna användas för experiment om förorenade med för mycket blod eller om dissekering försenas för länge i väntan på blödning att sluta. Ett annat vanligt dissekeringsfel är skador på prostatakörtelns kapsel som avsevärt försämrar MPG-visualisering och borttagning. Denna kapsel är en mycket känslig struktur som lätt punkteras samtidigt ta bort fettet från prostataväggen, även om du använder endast en bomullstippad applikator. Slutligen är de viktigaste nerverna i samband med MPG lätt skadas under processen att identifiera var och en och sedan under avlägsnande av MPG. Dissektorer uppmuntras att utveckla en rutin där varje nerv isoleras i sin tur, i en viss ordning, så att det finns mindre möjligheter till förvirring under de sista stegen i ganglion borttagning.
Denna dissekering försökte inte spåra var och en av komponenterna i tillbehörnerverna till specifika organ, eller för att identifiera var och en av de många mikroganglia som ligger på olika punkter mellan bäckenhålorna och bäckenorganen8. Dessa är ganska svårt att visualisera in vivo utan att använda specifika fläckar; emellertid, de kan tas bort genom att följa var och en av nervskrifter mot organen, och utnyttja specifika neurala fläckar post hoc för att bestämma ganglion plats. Dessa mikroganglier, även om endast en liten del av den neuronala populationen jämfört med MPG, kan ge specifika typer av bidrag till de organ som de är närmast belägna. Vi noterar här en begränsning på området att varken dessa mikroganglia eller många av de små nervområden som lämnar MPG för att resa till bäckenorganen men har i stort sett accepterat namn. Dessutom har en lika detaljerad studie av mikroganglia ännu inte utförts på honråttor.
Sammanfattningsvis ger det protokoll och scheman som tillhandahålls här forskare med verktyg för att studera de primära strukturerna som ger den autonoma nervtillförseln till bäckenorganen, liksom de stora perifera ledningarna av sensoriska nerver från lumbosacral dorsala rot ganglier som färdas via MPG till bäckenorganen.
The authors have nothing to disclose.
Forskning som rapporterades i denna publikation stöddes av office of the Director, National Institutes of Health, Stimulera perifer aktivitet för att lindra villkor (SPARC) Program, Award Number OT2OD023872. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna hos National Institutes of Health. Dr Bertrands stipendium i Dr. Keasts laboratorium finansierades av: Universitetssjukhuset i Nîmes, fakulteten av medicinen av Montpellier-Nîmes, Anslutningen Française de Chirurgie (AFC), Sociétéen Interdisciplinaire Francophone d”UroDynamique et de Pelvipérinéologie (SIFUD-PP) och people-programmet (Marie Curie Actions) i Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt REA-bidragsavtal Nr PCOFUND-GA-2013-609102, genom PRESTIGE-programmet som samordnas av Campus Frankrike.
Anti-calcitonin gene-related peptide; RRID AB_259091 | Merck | C8198 | |
Anti-nitric oxide synthase, RRID AB_2533937 | Invitrogen | 61-7000 | |
Anti-rabbit IgG, Cy3 tag, RRID AB_2307443 | Jackson | 711-165-152 | |
Anti-tyrosine hydroxylase, RRID AB_390204 | Millipore | AB152 | |
Dissecting microscope | Olympus | SZ40, SC | |
Dumont AA epoxy coated forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Dumont #5/45 curved forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
LED light source | Schott | KL 1600 | |
Micro-Adson forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14054-13 |