Karakterisering af In Vitro Differentiering af humane primære Keratinocytter ved RNA-Seq Analyse
Summary
Præsenteret her er en trinvis procedure for in vitro differentiering af menneskelige primære keratinocytter ved kontakt hæmning efterfulgt af karakterisering på molekylært niveau ved RNA-seq analyse.
Abstract
Menneskelige primære keratinocytter bruges ofte som in vitro modeller for undersøgelser af epidermal differentiering og relaterede sygdomme. Metoder er blevet rapporteret for in vitro differentiering af keratinocytter dyrket i to-dimensionelle (2D) neddykket manerer ved hjælp af forskellige induktion betingelser. Beskrevet her er en procedure for 2D in vitro keratinocyt differentieringsmetode ved kontakt hæmning og efterfølgende molekylær karakterisering af RNA-seq. Kort sagt dyrkes keratinocytter i defineret keratinocytmedium suppleret med vækstfaktorer, indtil de er fuldt sammenflydende. Differentiering er induceret af tætte kontakter mellem keratinocytter og yderligere stimuleres ved at udelukke vækstfaktorer i mediet. Ved hjælp af RNA-seq-analyser viser det sig, at begge 1) differentierede keratinocytter udviser forskellige molekylære signaturer under differentiering, og 2) det dynamiske genekspressionsmønster ligner stort set celler under epidermal stratificering. Med hensyn til sammenligning med normal keratinocyt differentiering, keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63 udviser ændret morfologi og molekylære signaturer, i overensstemmelse med deres differentiering defekter. Afslutningsvis beskriver denne protokol trinene for 2D in vitro keratinocyt differentiering og dens molekylære karakterisering, med vægt på bioinformatisk analyse af RNA-seq data. Da RNA-ekstraktion og RNA-seq-procedurer er veldokumenterede, er det ikke fokus for denne protokol. Den eksperimentelle procedure for in vitro keratinocyt differentiering og bioinformatik analyse rørledning kan bruges til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering i raske og syge keratinocytter.
Introduction
Menneskelige primære keratinocytter stammer fra den menneskelige hud bruges ofte som en cellulær model til at studere biologi i epidermis1,2,3,4. Stratificeringen af epidermis kan modelleres ved keratinocyt differentiering, enten i en 2D neddykket monolag mode eller 3D luft-lift organotypic model2,3,5,6,7. Selv om 3D-modeller er blevet stadig vigtigere at vurdere den epidermale struktur og funktion, 2D differentiering modeller er stadig meget udbredt, på grund af deres bekvemmelighed og muligheden for at generere et stort antal celler til analyse.
Der er anvendt forskellige betingelser for at fremkalde keratinocytdifferentiering i 2D, herunder tilsætning af serum, høj koncentration af calcium, lavere temperatur og hæmning af epidermal vækstfaktorreceptorer2,3. Hver af disse metoder er blevet valideret af en række keratinocyt differentiering markør gener og vist sig at være effektiv til at vurdere keratinocyt differentiering, herunder under patologiske forhold. Disse induktionsbetingelser viser imidlertid også forskelle i deres differentieringseffektivitet og kinetik, når specifikke paneler af markørgener undersøges2,3.
En af disse metoder indebærer keratinocyt kontakt hæmning og udtømning af vækstfaktorer i kulturen medium8. Det er blevet påvist, at keratinocytter kan skelne spontant, når cellerne når fuld tæthed. Hvis vækstfaktorerne i kulturmediet udelukkes, kan det yderligere øge differentieringen. Metoden, der kombinerer kontakthæmning og nedbrydende vækstfaktorer, har vist sig at generere differentierede keratinocytter med genekspressionsmønstre svarende til den normale lagdelte epidermis, når du bruger flere epidermalemarkører 3,hvilket tyder på, at denne model er egnet til at studere normal keratinocytdifferentiering. For nylig er der rapporteret om to omfattende genudtryksanalyser af keratinocytdifferentiering ved hjælp af denne model9,10. Forskere valideret denne model på det molekylære niveau og viste, at det kan bruges til at studere normal og syg keratinocyt differentiering.
Denne protokol beskriver proceduren for in vitro differentieringsmetode og molekylær analyse af differentierede celler ved hjælp af RNA-seq. Det illustrerer også karakterisering af transskription af celler på differentiering dag 0 (spredning fase), dag 2, dag 4, og dag 7 (tidlig, midterste og sen differentiering, henholdsvis). Det er vist, at differentierede keratinocytter viser genekspressionsmønstre, der stort set ligner celler under epidermal stratificering. For at undersøge, om denne metode kan bruges til at studere hudpatologi, vi anvendt den samme eksperimentelle og analyse pipeline til at undersøge keratinocytter regnskabsmæssige mutationer af transskription faktor p63, der er afledt af patienter med ectrodactyly, ectodermal displaasia og cleft læbe / gane (EØF) syndrom11,12. Denne protokol fokuserer på in vitro differentiering af keratinocytter samt efterfølgende bioinformatisk analyse af RNA-seq. Andre trin i den komplette procedure såsom RNA ekstraktion, RNA-seq prøve forberedelse og bibliotek konstruktion, er veldokumenteret og kan nemt følges, især når du bruger mange almindeligt anvendte kommercielle kits. Disse trin er derfor kun kort beskrevet i protokollen. Dataene viser, at denne rørledning er egnet til at studere molekylære hændelser under epidermal differentiering hos sunde og syge keratinocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde beskriver en metode til at fremkalde menneskelig keratinocyt differentiering og efterfølgende karakterisering ved hjælp af RNA-seq analyser. I den nuværende litteratur anvender mange undersøgelser af differentiering af humant keratinocyt to andre metoder, med en høj calciumkoncentration eller med serum som metoder til at fremkaldedifferentiering 2,3,23. En tidligere rapport nøje sammenlignet disse tre forskel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.) Radboud Universitetsstipendi (H.Z.); og kinesisk stipendium råd tilskud 201406330059 (JQ).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
References
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
