本明細書では、共培養実験に使用できるオリゴデンドロサイトの精製およびオリゴデンドロサイト条件培地の製造のための効率的な方法を示す。
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この記事について
サマリー
要約
中枢神経系では、オリゴデンドロサイトは軸索髄鞘の役割でよく知られており、塩基伝導を通じて作用電位の伝播を促進する。さらに、オリゴデンドロサイトが髄鞘を越えて、特に可溶性因子の分泌を通じてニューロンと相互作用することを示唆する報告が増えている。ここでは、アストロサイトやミクログリア細胞も含むグリア細胞培養物からオリゴデンドロイアル系統細胞を精製できる詳細なプロトコルを紹介する。この方法は、37°Cでの一晩の揺れに依存しており、上にあるオリゴデンドロア細胞とミクログリア細胞の選択的剥離、および微分接着によるミクログリアの排除を可能にする。次に、オリゴデンドロサイトの培養とオリゴデンドロサイトコンディショ化物(OCM)の生成について説明する。また、共同培養実験で精製された海馬ニューロンに加えてOCM治療またはオリゴデンドロサイトの動態を提供し、オリゴデンドロサイトとニューロンの相互作用を研究する。
概要
オリゴデンドロサイト(OLs)は、軸索の周りにミエリンを包む中枢神経系(CNS)のグリア細胞です。OLsは、オリゴデンドロビ細胞前駆体細胞(OPC)に由来し、胚性CNSの心室領域内で増殖し、完全に成熟したOL(すなわちミエリン形成細胞)1に移行して分化する。初期の発達中には多くのオペックが豊富であるが、成人の脳にも持続し、そこで主要な増殖細胞集団2を表す。単一のOLは、非興奮性セクション(すなわち、ノード間)で複数の軸索を包み込み、各ミエリンループの端は、ミエリン1、3の絶縁特性にとって重要である副線ドメインを形成する軸索に付着する。パラノードの間には、ランヴィエのノードと呼ばれる小さな髄を持たしない隙間があります。これらのノードは電圧ゲート付きナトリウムチャネル(Nav)が豊富で、塩基伝導4を介した作用電位の再生と急速な伝播を可能にする。この緊密な相互作用はまた、AL5、6からの乳酸の神経の取り込みを通じて軸索エネルギーサポートを可能にする。
オリゴデンドログリア系統細胞の成熟と髄鞘形成プロセスは、ニ....
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プロトコル
この実験におけるラットのケアと使用は、制度的な方針とガイドライン(UPMC、INSERM、および欧州共同体理事会指令86/609/EEC)に準拠しています。次のプロトコルは、12個の子犬の標準的なごみのために確立されています。
1. フラスコの調製(約5分)
注:滅菌状態の場合、層流フードで解剖の前日に次の手順を実行します。
- ポリエチレンミンの5 mL(PEI、100 mg/L、補足ファイル1のプロトコルを参照)を使用して、フィルターキャップ(2つの子犬のための1フラスコ)で150 cm2フラスコ(T150)をコーティングします。
- フラスコを一晩4°Cで保管してください。
- 解剖の日に滅菌蒸留水で3回コーティングされたフラスコをすすすります。
2. メディアの準備(約10分)
注:無菌状態の場合は、層流フードの手順を実行します。
- 500 mLの培養培地を調製し、10%の胎児子牛血清(FCS)およびペニシリンストレプトマイシン(100 IU/mL)を添加したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)からなる。
- 50 mLのチューブに酵素消化液20.6m....
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結果
このプロトコルでは、OL系統細胞は、アストロサイトおよびミクログリアを振り払うことによってグリア培養物から精製される。OL培養物の純度および風変わりに関する検査は、グリアマーカー15による免疫染色によって評価することができる。異なるマーカーの発現の分析は、OL培養が主にO4+細胞の90%±4%、85%±7%NG2+細胞、およびPLP+細胞の4.7%±2.1%のプレオールであり、7.2%±2.5%の細胞がGFAP+アストロサイト(平均±S.D.、n= 3;)図 2を参照してください。また、4.6%±0.7%の細胞はCD11b+ミクログリア細胞であった(平均±S.D.、図示しない)。
このような培養物から産生されるOCMは、精製された海馬ニュ.......
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ディスカッション
ここでは、混合グリア培養物から高度に濃縮されたオリゴデンドログリア系細胞培養物を得るための詳細なプロトコルを提供し、先に公表した方法16から適応し、その後のOL条件培地の製造を行う。この振れ技術は高価ではないが、3回繰り返し、また、PDGFαを含むボッテンシュタイン・サト(BS)培地で培養した細胞が増殖するように、高量の精製オールを得るのに最適である。グリア細胞は、P2におけるウィスターラットの大脳皮質を用いて調製され、オリゴデンドログリア系細胞の大部分がNG2およびO415を発現するオリゴデンドロサイト前である時点である。注目すべきは、OL系統成熟はマウスとラットのP2でも同様であり、このプロトコルは、マウスプリオリゴデンドロサイト17を単離するためにも使用することができる。
混合グリア細胞培養液を振った後、切り離された細胞は主にオリゴデンドログリア系細胞からなるが、一部のミクログリア細胞と少数のアストロサイトも含まれる。ミクログリア細胞.......
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開示事項
著者の誰も競合する利益や相反する利益を持っていません。
謝辞
著者らは、レミ・ロンツァーノの原稿編集における賢明なアドバイスに感謝したいと思います。この作品は、ICM、INSERM、NSFへのARSEP財団助成金、ブーヴェ・ラブリュイエールの価格によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 5-フルオロデオキシウリジン | Sigma F0503 | ||
| B27 サプリメント | サーモフィッシャー | 17504044 | |
| D-(+)-グルコース溶液 | Sigma | G8769 | |
| DNase (デオキシリボヌクレアーゼ I) | ワージントン | LS002139 | |
| ダルベッコのモディファイド イーグル ミディア | サーモフィッシャー | 31966021 | |
| エタノール 100% | シグマ | 32221-M | |
| エタノール70% | VWR化学薬品 | 83801.360 | |
| 胎児子牛血清 | サーモフィッシャー | 10082147 | |
| L-システイン | グマ | C7352 | |
| 神経基礎 | サーモフィッシャー | 21103049 | |
| パパイン | ワーシントン | LS003126 | |
| ペニシリンストレプトマイシン | サーモフィッシャー | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 カルシウムとマグネシウムなし | サーモフィッシャー | A1285601 | |
| ポリエチレン(PEI) | シグマ | P3143 | |
| 四ホウ酸塩十水和物 | シグマ | B9876 | |
| トリプシン | シグマ | シグマ | |
| ウリジン | シグマ | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (ウシ血清アルブミン) | Σ | A4161 | |
| ダルベッコ修正イーグル 培地 | サーモフィッシャー | 31966021 | |
| インスリン | Σ | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャー | 15140122 | |
| プロゲステロン | Σ | P8783 | |
| プトレシン二塩酸塩 | Σ | P5780 | |
| 亜セレン酸ナトリウム | Σ S5261 | ||
| T3 (3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩) | Σ | T6397 | |
| T4 (L-チロキシン) | Σ | T1775 | |
| <強>共培養培地 | |||
| アポトランスフェリンヒト | Σ T1147 | ||
| B27 サプリメント | サーモフィッシャー | 17504044 | |
| ビオチン | Σ | B4639 | |
| BSA(ウシ血清アルブミン) | Σ | A4161 | |
| セルロプラスミン | シグマ | 239799 | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム | サーモフィッシャー | 31966021 | |
| ヒドロコルチゾン | Σ H4001 | ||
| インスリン | Σ I5500 | ||
| N-アセチル-L-システイン | Σ A8199 | ||
| ニューロベース | サーモフィッシャー | 21103049 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | サーモフィッシャー | 15140122 | |
| プロゲステロン | シグマ | P8783 | |
| トレシン | シグマ | P5780 | |
| 換えヒトCNTF | シグマ | 450-13 | |
| セレン酸ナトリウム | シグマ | S5261 | |
| T3(3,3',5-トリヨード-L-チロニンナトリウム塩) | シグマ | T6397 | |
| ビタミンB12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm フィルター | ザルトリウス | 514-7010 | |
| 1 mL シリンジ | テルモ | 1611127 | |
| 100 mm ペトリ皿 | ダッチャー | 193100 | |
| 15 mL チューブ | コーニング ライフサイエンス | 734-1867 | |
| 50 mL チューブ | コーニング ライフサイエンス | 734-1869 | |
| 60 mm ペトリディッシュ | ダッチャー | 067003 | |
| 70 &マイクロ;mフィルター | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| 双眼顕微鏡 | オリンパス | SZX7 | |
| 湾曲した鉗子 | ファインサイエンスツール | 11152-10 | |
| ファイン | サイエンス ツール | 91150-20 | |
| 大型手術用ハサミ | ファイン サイエンス ツール | 14008-14 | |
| メス | スワン・モートン | 233-5528 | |
| シェー | カーInforsHT | ||
| 小型外科用はさみ | ファインサイエンスツール | 91460-11 | |
| 小型外科用スプーン | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2フィルターキャップ付きフラスコ | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2Wistarラット | Janvier | RjHAn:WI |
参考文献
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Broph....
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