定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析
Summary
本議定書では、先天性心不全に関連するマウスの発達表現型を定性的かつ定量的に分析する手順を説明する。
Abstract
先天性心不全(CHD)は、ヒトの出生時欠損の最も一般的なタイプであり、すべての出生の最大1%に影響を及ぼす。しかし、CHDの根本的な原因はまだ十分に理解されていません。開発中のマウスは、マウスとヒトの間の心臓発達プログラムが非常に保存されているため、CHDの研究にとって貴重なモデルです。プロトコルは、所望の妊娠段階のマウス胚を生成する方法、下流処理のために心臓を分離して保存する方法、構造学によってCHDの一般的なタイプを識別する定量的方法(例えば、心室中隔)を詳細に記述する欠陥、心房中隔欠損、特許性管管動脈管)、および定量的な構造学法は、一般的な筋圧膜型を測定する。これらの方法は、サンプルの調製、収集、および分析に関与するすべてのステップを明確にし、科学者がCHDを正しく、再現的に測定することを可能にします。
Introduction
CHDは、ヒトにおける出生時欠損の最も一般的なタイプであり、出生時欠損関連死の主な原因である1、2、3、4、5、6。新生児の約90%がCHDを生き残っているが、それはしばしば、患者の生活と医療システム7、8、9、10に大きな負担を課す、長年にわたって重大な罹患率および医学的介入に関連している。純粋に遺伝的要因の外では、CHDの原因は十分に理解されていません4.未確認の原因は、米国心臓協会およびその他の情報源2、3、4、11によると、すべてのCHD症例の約56-66%を占める。既知の因子には、遺伝子変異、CTV、デノボ単一ヌクレオチド変異、および異数体が含まれる。母体の生活様式2、12、経済的剥奪、および人種13を結ぶ疫学的研究によって示唆されるように、環境および食事因子もCHDに寄与する重要な供給源であると疑われる。CHDおよび他の心血管欠損のメカニズムと原因を調査することは、予防戦略および新しい治療オプション1、4、17、18、19を開発するために重要である。
開発中のマウスは、哺乳類のCHDを研究するための基礎モデルです。しかし、心臓形態を保存する分節、発達段階の分析、CHD関連欠陥の同定など、採用された方法や分析の中には、マウスの心臓の分析に新しい科学者にとっては困難な場合があります。このプロトコルで説明されている方法の目的は、これらのプロセスに対して定性的かつ定量的なガイドラインを提供することです。したがって、このプロトコルでは、所望の妊娠期の胚を産生するために時間交配を行い、無傷の心臓回復(流出路などの関連組織を含む)、心臓固定および準備のために妊婦を解剖する方法を説明するクライオスタット断面化、基本的な構造学的方法、一般的な心臓欠損の定量的分析、および心筋圧密の定性的分析は、いくつかのタイプのCHDに対する一般的な前駆体表現型である。
Protocol
本論文で参照されている実験で使用されたすべての動物は、ミシガン州立大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の動物ケアガイドラインを使用して治療した。 1. 胚生成のためのC57BL6/Jマウスのタイミング交配 マウスが繁殖年齢(6-8週間)に達したら、ハーレム繁殖形式(すなわち、1匹の雄1匹につき2匹の雌)にまとめる。午後または夕方に繁殖のためにそれらを設定?…
Representative Results
筋肉圧指数は、コントロールと実験群の2つの異なる環境下で発達する心臓の間で比較された。これらのプロトコルは、筋肉組織の圧縮を定量的に分析するために使用され、統計的分析が可能であった。筋肉圧圧は、非実験的条件で発症した胚に対して実験心臓において有意に減少することが示された。 観察のタイミング?…
Discussion
このプロトコルは、胚性心臓における心臓発達の分析に関与する技術を探る。この方法のいくつかの制限は、準備技術に必要な物理的な器用さであり、練習を必要とし、顕微鏡イメージングを伴うスキルを有する。クライオスタットで得られたスライスが乱雑な場合、ヘマトキシリンとエオシン染色が明確でない場合、または顕微鏡で撮影した画像の照明が悪い場合、ImageJで使用される方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アギーレ研究所は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464の下で、賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされています。
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
Cite This Article
Ball, K., Kinne, R., Aguirre, A. Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods. J. Vis. Exp. (157), e60926, doi:10.3791/60926 (2020).