Kovalent vedlegg av sondemolekyler til atomkraftmikroskopi (AFM) cantilever tips er en viktig teknikk for undersøkelse av deres fysiske egenskaper. Dette gjør at vi kan bestemme strekkkraften, desorpsjonskraften og lengden på polymerer via AFM-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi med høy reproduserbarhet.
Atomkraftmikroskopi (AFM)-basert enkeltmolekylkraftspektroskopi er et ideelt verktøy for å undersøke interaksjonene mellom en enkelt polymer og overflater. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondemolekylet avgjørende fordi bare da kan hundrevis av kraftforlengelsesspor med ett og samme enkeltmolekyl oppnås. Mange spor er i sin tur nødvendig for å bevise at et enkelt molekyl alene er undersøkt. I tillegg er passivisering avgjørende for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobemolekylet og AFM cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan enkelt brukes på en rekke polymerer. Karakteristiske enkeltmolekylhendelser (dvs. strekninger og platåer) oppdages i kraftforlengelsessporene. Fra disse hendelsene kan fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde oppnås. Dette er spesielt viktig for den nøyaktige undersøkelsen av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå. Som eksemplariske systemer poly(etylen glykol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) og polystyren (PS) er strukket og desorbed fra SiOx (for PEG og PNiPAM) og fra hydrofobe selvmonterte monolayer overflater (for PS) i vandig eskeidige omgivelser.
Siden oppfinnelsen på 1980-tallet1har atomkraftmikroskopet (AFM) blitt en av de viktigste bildeteknikkene i naturvitenskap med subnanometer romlig oppløsning, sub-piconewton kraftoppløsning og muligheten for måling i ulike løsemiddel- og temperaturforhold2,3,4,5,6,7.
Bortsett fra bildebehandling8,9, AFM brukes til å utføre enkelt molekyl kraft spektroskopi (SMFS) gir innsikt i klebende interaksjoner mellom en enkelt polymer og overflater, fysiske egenskaper av enkelt polymerer og utfoldende mekanismer av proteiner7,10,11,12,13,14,15,16. I et vanlig SMFS-eksperiment blir den funksjonaliserte cantilever-spissen brakt i kontakt med en overflate slik at polymeren ved AFM cantilever tipper fysisorber til denne overflaten. Ved å trekke Tilbake AFM cantilever spissen fra overflaten, en endring i nedbøyning av AFM cantilever konverteres til en kraft som fører til en kraft-forlengelse kurve4. Fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde kan bestemmes som avhengig av ulike parametere som trekkhastighet, botid på overflaten, innrykkdybde inn i overflaten, temperatur, løsningsmiddel17,18 og forskjellige overflater som faste underlag, polymerfilmer eller støttet lipidbilag19,,20,,21,,22. Videre kan en polymer undersøkes i forskjellige romlige retninger, og dermed undersøke friksjonsegenskapene til polymeren23,24,25,26.
En kovalent tilknytning av den undersøkte polymeren til en AFM cantilever tips er avgjørende for slike studier. Dermed forhindrer et høyt utbytte av enkeltmolekylhendelser med en og samme polymer bundet til en AFM cantilever tips noen skjevhet av resultatene på grunn av kalibrering av fjærkonstanten av AFM cantilever27,28, varierende festepunkter29 eller varierende polymerer (med forskjellige konturlengder) som i tilfelle nanofiskeeksperimenter30,31,32. Også interaksjoner med andre polymerer samt snitteffekter kan forebygges mye18,28. For kovalent vedlegg av en polymer til AFM cantilever tips, ulike typer kjemiske modifikasjoner kan brukes, hvorav mange er oppsummert i boken av Hermanson33. Amine og tiol-baserte koblingreaksjoner samt klikkkjemi representerer de mest brukte metodene i AFM cantilever tips funksjonalisering34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 viser hvordan du bruker 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) / NHS kjemi for å feste et protein til en AFM cantilever tips. Men de nevnte funksjonelle gruppene har en tendens til å krysskoble, og dermed fører til tap av funksjonalitet43,44. Også karbodiimides viser en tendens til rask hydrolyser i løsning43. Maleimide og tiol grupper er generelt mer stabile og viser ikke krysskoblinger reaksjoner. Den presenterte protokollen er en optimalisering av tidligere publiserte protokoller gitt i referanser35,39.
Her presenteres en pålitelig funksjonaliseringsprotokoll som enkelt kan justeres til et stort antall forskjellige polymerer, uavhengig av egenskaper som konturlengde eller hydrofobiitet. Tre forskjellige polymerer ble valgt som eksempel: hydrofil polyetylenglykol (PEG) og poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) samt høy molar masse hydrofobe polystyren (PS). For å sikre en kovalent bindende evne med et passende linkermolekyl, ble de tre polymerene valgt for å ha en telechelsk tiol moiety som funksjonell sluttgruppe. Linkermolekylet i seg selv er vanligvis en kort PEG-polymer med to aktive steder, en silane-gruppe i den ene enden og en maleimidgruppe i den andre enden. Førstnevnte muliggjør et kovalent vedlegg til AFM cantilever-spissen og sistnevnte en bindende reaksjon med den tiolske gruppen av den funksjonaliserte høy molarmassepolymeren. Videre fungerer inaktive PEG linker molekyler som et passiviseringslag for å forhindre uønskede interaksjoner mellom sondepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-kantileverspissen og den underliggende overflaten.
AFM-baserte SMFS er et av de viktigste verktøyene for å undersøke enkeltmolekylinteraksjoner i polymerfysikk. For et ekte enkeltmolekyleksperiment er kovalent tilknytning av sondepolymeren til en AFM-cantilever-spiss avgjørende.
Mange tidligere verk er basert på nanofiskeeksperimenter, spesielt for PNiPAM, hvor polymerer adsorseres på en overflate og deretter strekkes ved å tilfeldig plukke dem fra substratet ved hjelp av en AFM cantilever tips30,31. Dette kan endre resultatene og føre til feiltolkning av enkeltmolekylatferd. Der kan samarbeidseffekter dominere resultatene fordi interaksjoner med nærliggende polymerer ikke kan utelukkes. Dette har stor innvirkning på resultatene, spesielt for polymerer som viser betydelig forskjellig oppførsel i bulk sammenlignet med enkelt isolerte molekyler57,58.
Funksjonaliseringsprotokollen som presenteres her er pålitelig og kan lett brukes på forskjellige polymerer, uavhengig av konturlengde, hydrofobiitet eller den steriske hindringen av monomerene. I tillegg er det gitt en passivisering for å forhindre uønskede interaksjoner mellom enkeltprobepolymeren og AFM-cantilever-spissen, samt mellom AFM-cantilever-spissen og den underliggende overflaten. Videre vises evalueringen av kraftutvidelseskurver som viser strekkhendelser. Der foreslås det en prosedyre for fastsettelse av master force-extension kurver. Dette gir et bedre middel til å avsløre, for eksempel temperaturrelaterte effekter på kraftforlengelsesatferden. Videre er analysen av enkeltmolekyl desorpsjonhendelser med konstant kraftplatåer gitt. Også en enkel måte å korrigere sinusikotale kraftsignalartefakter i kraftforlengelseskurver er gitt som ellers kan svekke resultatene av eksperimentet.
Sammenlignet med Stetter et al.39, er funksjonaliseringsprosedyren som presenteres her redusert til tre trinn i stedet for fire og robustheten i prosedyren forbedres. Den store fordelen med å utføre PEGylation og silanization i ett trinn er å ha en bedre kontrollert reaksjon og å øke utbyttet. Videre må færre løsninger være forberedt og det kreves færre sneringsskritt. Dette reduserer innsatsen og tiden for forberedelse og øker reproduserbarheten. Videre er flytting av AFM-cantilevers alltid en kritisk del av funksjonaliseringsprosessen. En overføring fra en løsning til den andre risikerer alltid å påvirke funksjonaliseringskvaliteten på grunn av overføringer gjennom luftvanngrensesnittet eller for å miste AFM-cantilevers ved feil bruk av pinsett.
For å bevise riktig kovalent vedlegg av en enkelt polymer til en AFM cantilever tips forskjellige forhold må oppfylles. For det første er kontroll-AFM-cantilevers av betydelig betydning og bør være forberedt på hver funksjonalisering. Tilpasningsprosessen og væskecellen for å utføre eksperimentene anses bare å være rene, hvis et lite antall kraftutvidelseskurver viser strekninger eller platåer i kontrolleksperimentet (i de presenterte eksemplene mindre enn 2%).
Et klart strekkmønster uten ytterligere dråper eller maxima er avgjørende for å ha riktige enkeltmolekylsstretchinghendelser. I tillegg bør avhengigheten av bruddkraft på kraftbelastningshastigheten ved brudd eller fullstendig elastisk respons fra strekkkurven analyseres for å utelukke samtidig desorpsjon av flere polymerer59,60. For PEG og PNiPAM viste 19 % og 42 % av kraftforlengelseskurvene som ble tatt i forskjellige posisjoner av overflaten, et slikt strekkmønster. For å oppnå strekkhendelser må kissisorpsjonen av polymeren til den respektive underliggende overflaten være sterk. Ellers observeres en platålignende desorpsjonshendelse. Dette er enda mer avgjørende for påvisning av strekkhendelser ved høye krefter (opptil 500 pN eller mer). Siden denne sterke fysisorpsjonen ikke oppfylles for hver kraftforlengelseskurve, er utbyttet av slike hendelser mindre enn for rene platålignende desorpsjonshendelser. Som et alternativ kan sterkt befølgegrupper som kategorikoler eller chemisorption mellom polymer og underliggende overflate brukes. Dette krever imidlertid innføring av ytterligere funksjonelle grupper eller koblingssteder vedpolymer61,62.
Faktisk gir massen (dvs. konturlengde) av polymeren et verdifullt fingeravtrykk. Selv om massen ikke direkte kan oversettes til den målte konturlengden av følgende grunner, er lengdefordelingen svært verdifull for å definere enkeltmolekylhendelser. I tilfelle av en PNiPAM polymer medƉ lav polydispersitet ( 1,28), fant vi betydelige forskjeller i forlengelsesverdiene for de oppnådde strekkhendelsene (og dermed i polymerlengden) i forsøkene. En grunn til dette kan være fastsettelse av polymerlengden og dens fordeling. I størrelse-eksklusjon kromatografi (SEC), bestemmes en relativ vekt av målpolymeren i forhold til standarder som PS eller poly (metylmetakrylat) (PMMA)63. Den antatte relative vekten forventes å avvike fra den absolutte molekylvekten fordi den hydrodynamiske radiusen til målpolymeren og standarden kan variere betydelig. I tillegg kan silane laget bli oligomerized av falskt vann i toluen under funksjonaliseringsprosessen. Vedlegget av slike oligomers til AFM cantilever tips fører til et mer fleksibelt lag med færre ankerpunkter64. Også festepunktet til polymeren til silisiumlaget kan ikke nødvendigvis være på toppen som fører til et skifte av de oppdagede lengdeverdiene29. Mens en polymermodell som ormlignende kjede (WLC) eller den fritt felles kjede (FJC) modellen ikke kan reprodusere den respektive kraftforlengelsesvirkemåten for PEG eller PNiPAM riktig over hele forlengelsesområdet18,,29,41,65,66, kan en slik polymermodell være verdifull for andre polymere og proteinsystemer10,15,67,68.68
Kovalent vedlegg av en enkelt PS polymer (med en konturlengde på mer enn 1 μm) anses bare å være vellykket, når et betydelig antall kraftforlengelseskurver viser et langt nok platå med konstant kraft (figur 5). Et platå som følge av desorbing en enkelt polymer er definert av en enkelt skarp dråpe av en konstant kraft til baseline ved en viss forlengelse, som gitt i figur 5A. Hvis flere polymerer er festet til AFM cantilever-spissen, observeres en kaskade av platåer56 (figur 5C). Platålengden (desorpsjonslengde), korrelerer med polymerkonturlengden51,må være betydelig lengre enn noen vedhefttopp på grunn av uspesifikk vedheft av AFM cantilever-spissen til den underliggende overflaten (her rundt 200 nm). Funksjoner som vises utelukkende i en enkelt kraftforlengelseskurve, bør ikke tolkes. I de presenterte eksperimentene viste minst 80 av 100 kurver et platå som varer lenger enn 200 nm i minst to kraftkart på to forskjellige steder på overflaten. Videre avslører fordelingen av desorpsjonslengder, ved hjelp av scatter-plott som gitt i figur 5B og 5D,om og hvor mange polymerer som er bundet til AFM cantilever-spissen. I tilfelle av PS fungerte en smal fordeling av desorpsjonskraft og lengde tatt fra platåer av kraftforlengelseskurvene som bevis på et vellykket kovalent vedlegg. Dette viste endelig suksessen til funksjonaliseringsprotokollen. Dermed anbefaler vi på det sterkeste å presentere slike kraft- og lengdefordelinger i publikasjoner.
Evaluering av kraftutvidelseskurver ved hjelp av innebygde algoritmer som utgjør mange forhåndsinnstilte parametere, bør gjøres med forsiktighet. Årsakene er for eksempel at en fast samplingsfrekvens ikke passer for hver brukt trekkhastighet, eller at en automatisert utjevning av kraftforlengelseskurvene kan gjennomsnittlig ut viktige detaljer. Vanligvis kan en riktig forståelse av den respektive evalueringsprosedyren forhindre feil i evalueringsprosedyren, noe som igjen kan påvirke de endelige funnene fra et AFM-basert SMFS-eksperiment sterkt.
Oppsummert presenterer vi en funksjonaliseringsprotokoll som er pålitelig og lett kan brukes på en rekke polymerer. Videre presenteres riktig evaluering av enkeltmolekylkraftforlengelseskurver, noe som tillater bestemmelse av fysiske parametere som strekkkraft, desorpsjonskraft og desorpsjonslengde. De presenterte protokollene og prosedyrene er verdifulle for undersøkelse av stimuli-responsive systemer på enkeltmolekylnivå.
The authors have nothing to disclose.
B.N.B. og T.H. anerkjenner finansiering av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellence strategi – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie des Bundes und der Länder – EXC-2193/1 – 390951807, og gi HU 997/1-13 (prosjekt # 420798410). M.G. anerkjenner delvis støtte i rammen av LOEWE Project iNAPO av Hessen State Ministry of Higher Education, Research and the Arts. Vi takker Dr. Wolfgang Bronner og Dr. Agne Zukauskaite fra Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF for donasjon av høy kvalitets gullbelagte silisiumwafers.
1-Dodecanethiol (≥98%) | Sigma-Aldrich, USA | 417364-500ML | Used for SAM |
Ammonia solution (30%) | Roth, Germany | CP17.2 | Used for cleaning |
Cypher ES | Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA | – | AFM |
Ethanol (≥99.9%) | Roth, Germany | PO76.1 | Solvent |
Gold coated silicon wafer | Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany | – | Used for SAM |
High Resolution Replicating Compound | Microset Products Ltd, UK | 101RF | Bonding agent |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Used for cleaning |
Igor Pro | Wavemetrics, USA | – | Software environment |
Tetra-30-LF-PC | Diener Electronic, Germany | – | Plasma chamber |
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane | Creative PEG works, USA | PHB-1923 | Linker polymer |
MLCT-Bio-DC | Bruker, USA | MLCT-Bio-DC | AFM cantilever |
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm | MicroChemicals, Germany | WSA40600250 P1314SNN1 | Silicon wafer |
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm | Elga LabWater, Germany | 10034-540 | Ultrapure water source |
R3 SA | Vomm GmbH, Germany | 5803 Blank | Tweezers |
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) | Gallei Group, Saarland University, Germany | – | PNiPAM probe polymer |
Thiol terminated polystyrene | Polymer Source, Canada | P40722-SSH | PS probe polymer |
Thiol-polyethylene glycol-thiol | Creative PEGWorks, USA | PSB-615 | PEG probe polymer |
Toluene (99.99%) | Fisher Chemicals | T324-500 | Solvent |