التقليدية BODIPY Conjugates ليعيش الخلية فائقة القرار المجهر وتتبع جزيء واحد
Summary
يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للخلية الحية جزيء واحد المجهري ة توطين (SMLM) من خلال استغلال بهم تشكيل عابرة، والأحمر تحول الدولة الخافتات. نحن نقدم بروتوكول SMLM الأمثل لتتبع وحل الدهون المحايدة دون الخلوية والأحماض الدهنية في الثدييات الحية وخلايا الخميرة على مقياس طول nanoscopic.
Abstract
تقنيات المجهر توطين جزيء واحد (SMLM) التغلب على حد الحيود البصري من المجهر الفلوري التقليدية ويمكن حل الهياكل داخل الخلايا وديناميات الجزيئات الحيوية مع ~ 20 نانومتر الدقة. ومن الشروط الأساسية لـ SMLM الفلوروفوريات التي تنتقل من حالة مظلمة إلى حالة فلورية من أجل تجنب التداخل الزمني للنقاط التي تعمل على نشر النقاط في كل من آلاف إطارات الحصول على البيانات. BODIPYs هي الأصباغ الراسخة مع العديد من المتجانسات المستخدمة في المجهر التقليدي. ينتج عن التكوين العابر للديمنات الأرضية ذات الحالة الأرضية التي تحولت من BODIPY (DII)انبعاثات جزيء واحد مشرقة تمكن من إجراء المجهر توطين جزيء واحد (SMLM). هنا نقدم بروتوكول بسيط ولكن تنوعا لSMLM مع الاقتران اتبوبي التقليدية في الخميرة الحية وخلايا الثدييات. ويمكن استخدام هذا الإجراء للحصول على صور فائقة الدقة وتتبع حالات بودي ديالثاني واحدة لاستخراج المعلومات الزمنية spatio من الاقترانات BODIPY. نحن نطبق هذا الإجراء لحل قطرات الدهون (LDs) ، والأحماض الدهنية ، والليسوسومافي ة الخميرة الحية وخلايا الثدييات على مقياس طول النانسكوبي. وعلاوة على ذلك، ونحن نظهر قدرة التصوير متعددة الألوان مع الأصباغ BODIPY عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تحقيقات الفلورسنت الأخرى. تظهر نتائجنا التمثيلية التوزيع المكاني التفاضلي وحركة الأحماض الدهنية BODIPY والدهون المحايدة في الخميرة في ظل ظروف التغذية والصيام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول الأمثل لSMLM مع مئات من المجمعات المتاحة تجاريا BODIPY وهو مورد مفيد لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو أبعد بكثير من تطبيقات هذا العمل.
Introduction
ظهرت تقنيات المجهر المجهري ة ذات الجزيء الواحد (SMLM) مثل المجهر الضوئي لإعادة البناء العشوائي (STORM) والمجهر التوطين المنشط بالصور (PALM) كطرق لتوليد صور فائقة الدقة مع معلومات تتجاوز حد الحيود البصري لآبي1،2 ولتتبع ديناميكيات الجزيئات الحيوية المفردة3،4. أحد متطلبات المسابير المتوافقة مع SMLM هو القدرة على التحكم في عدد الفلوروبورورس النشط في أي وقت لتجنب التداخل المكاني لوظائف انتشار النقاط (PSF). في كل من الآلاف من إطارات الحصول على البيانات ، يتم تحديد موقع كل فلوروفوريس الفلورسنت مع ~ 20 نانومتر الدقة عن طريق تركيب وظيفة انتشار نقطة المقابلة. تقليديا، وقد تم التحكم في وامض على قبالة من الفلوروفوراس من خلال تبديل الضوئي stochastic1،,2،,5 أو الناجمة كيميائيا الوميض الجوهرية6. وتشمل النهج الأخرى التنشيط المستحث للفلوروجين اتّلى على ربط عابر لبروتين الفلوروجين المنشط7،,8 والربط غير الملزم للبرمجة من oligomers الحمض النووي المسمى في الفلورسة الانعكاسية الداخلية الكلية (TIRF) أو إثارة ورقة الضوء9. في الآونة الأخيرة ، أبلغنا عن استراتيجية جديدة ومتعددة الاستخدامات لـ SMLM10 التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا مع تغير اللون الأحمر (DII)حالات البورون التقليدية دي بيروميثان (BODIPY) التي تتجاور11،12،13 تتشكل بشكل عابر وتصبح متحمسة على وجه التحديد ويتم اكتشافها مع أطوال موجية ذات تحول أحمر.
BODIPYs هي الأصباغ المستخدمة على نطاق واسع مع مئات من المتغيرات التي تسمية على وجه التحديد المقصورات دون الخلوية والجزيئات الحيوية14،15،16. بسبب سهولة استخدامها وتطبيقها في الخلايا الحية ، تتوفر متغيرات BODIPY تجاريًا للتنظير المجهري التقليدي للفلورسينس. هنا ، نحن نصف بروتوكول مفصل والأمثل حول كيفية مئات من المتاحة تجاريا BODIPY conjugates يمكن استخدامها ليعيش الخلية SMLM. من خلال ضبط تركيز مونومرات BODIPY وعن طريق تحسين قوى الليزر الإثارة ، يتم الحصول على معلمات التصوير وتحليل البيانات والصور عالية الدقة عالية الدقة وبيانات تتبع الجزيء الواحد في الخلايا الحية. عند استخدامها بتركيز منخفض (25-100 nM)، يمكن استخدام الاقترانات بوديبي في وقت واحد لSMLM في القناة الحمراء التحول وللمجهرية الفلورية التقليدية القرابة في قناة الانبعاثات التقليدية. يمكن تحليل بيانات الجزيء الواحد التي تم الحصول عليها لتحديد التنظيم المكاني للهياكل غير المتنقلة واستخراج الحالات المنحلة للجزيئات في الخلايا الحية17. توافر تحقيقات BODIPY في كل من الأشكال الخضراء والحمراء يسمح للتصوير متعدد الألوان عند استخدامها في المزيج الصحيح مع الفلوروفوريات الأخرى المتوافقة.
في هذا التقرير، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل للحصول على وتحليل البيانات الخلية الحية SMLM باستخدام BODIPY-C12،BODIPY (493/503)، BODIPY-C12 الأحمر وlysotracker-الأخضر في ألوان متعددة. نحن حل الأحماض الدهنية والدهون محايدة في الخميرة الحية وخلايا الثدييات مع ~ 30 نانومتر القرار. ونحن نثبت كذلك أن خلايا الخميرة تنظيم التوزيع المكاني للأحماض الدهنية المضافة خارجيا اعتمادا على حالتها الأيضية. نجد أن وأضاف BODIPY الأحماض الدهنية (FA) التوطين إلى التحمية الإندوسلية (ER) وقطرات الدهون (LDs) في ظل ظروف تغذية في حين BODIPY-FAs تشكل مجموعات غير LD في غشاء البلازما عند الصيام. كما نقوم بتوسيع نطاق تطبيق هذه التقنية إلى صورة الليسوسوماوسومات والمواد LDs في خلايا الثدييات الحية. لدينا بروتوكول الأمثل لSMLM باستخدام الاقترانات BODIPY التقليدية يمكن أن يكون موردا مفيدا لدراسة العمليات البيولوجية على مقياس النانو مع عدد لا يحصى من الاتزان اتّهاب ة BODIPY المتاحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، أظهرنا كيف يمكن استخدام الاقترانات التقليدية BODIPY للحصول على صور SMLM مع ترتيب تحسن الحجم في الاستبانة المكانية. ويستند هذا الأسلوب على استغلال الحالات التي تم الإبلاغ عنها سابقا، والأحمر تحول DII من الأصباغ بودي التقليدية، والتي تشكل بشكل عابر من خلال لقاءات ثنائية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم البحث الوارد في هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
