Conventionele BODIPY Conjugates voor Live-Cell Super-Resolution Microscopie en Single-Molecule Tracking
Summary
Conventionele BODIPY conjugaten kunnen worden gebruikt voor live-cel single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) door de exploitatie van hun tijdelijk vormende, rood verschoven grond staat dimers. We presenteren een geoptimaliseerd SMLM-protocol om subcellulaire neutrale lipiden en vetzuren in levende zoogdier- en gistcellen op nanoscopische lengteschaal te volgen en op te lossen.
Abstract
Single molecule lokalisatie microscopie (SMLM) technieken overwinnen de optische diffractie limiet van conventionele fluorescentie microscopie en kan intracellulaire structuren en de dynamiek van biomoleculen met ~ 20 nm precisie op te lossen. Een voorwaarde voor SMLM zijn fluoroforen die de overgang van een donkere naar een fluorescerende toestand om spatio-temporele overlap van hun point spread functies in elk van de duizenden data acquisitie frames te voorkomen. BODIPYs zijn gevestigde kleurstoffen met tal van conjugaten gebruikt in conventionele microscopie. De voorbijgaande vorming van rood-verschoven BODIPY grond-staat dimers (DII) resulteert in heldere single molecule emissie waardoor single molecule lokalisatie microscopie (SMLM). Hier presenteren we een eenvoudig maar veelzijdig protocol voor SMLM met conventionele BODIPY conjugaten in levende gist- en zoogdiercellen. Deze procedure kan worden gebruikt om beelden met superresolutieII te verkrijgen en om afzonderlijke BODIPY-D II-toestanden te volgen om spatio-temporele informatie van BODIPY-verenigwonden te extraheren. We passen deze procedure toe om lipidedruppels (ID’s), vetzuren en lysosomen in levende gist- en zoogdiercellen op te lossen op nanoscopische lengteschaal. Bovendien tonen we de multi-color imaging vermogen met BODIPY kleurstoffen bij gebruik in combinatie met andere fluorescerende sondes. Onze representatieve resultaten tonen de differentiële ruimtelijke verdeling en mobiliteit van bodipy-vetzuren en neutrale lipiden in gist onder gevoede en nuchtere omstandigheden. Dit geoptimaliseerde protocol voor SMLM kan worden gebruikt met honderden commercieel beschikbare BODIPY conjugaten en is een nuttige bron om biologische processen op nanoschaal tot ver buiten de toepassingen van dit werk te bestuderen.
Introduction
Single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) technieken zoals stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) en foto-geactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) zijn ontstaan als methoden voor het genereren van super-resolutie beelden met informatie buiten abbe’s optische diffractie limiet1,2 en voor het bijhouden van de dynamiek van singlemolecules3,4. Een van de vereisten voor sondes die compatibel zijn met SMLM is de mogelijkheid om het aantal actieve fluoroforen op elk gewenst moment te controleren om ruimtelijke overlappingen van hun point spread-functies (PSF) te voorkomen. In elk van de duizenden data-acquisitie frames, de locatie van elke fluorescerende fluorofoforen wordt vervolgens bepaald met ~ 20 nm precisie door montage van de bijbehorende point-spread functie. Traditioneel is het aan-uit knipperen van fluoroforen gecontroleerd door stochastische fotoswitching1,2,5 of chemisch geïnduceerde intrinsieke knipperende6. Andere benaderingen zijn de geïnduceerde activering van fluorogenen bij tijdelijke binding aan een fluorogeneactiverend eiwit7,8 en de programmeerbare binding-unbinding van gelabelde DNA-oligomeren in totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) of lichtbladexcitatie9. Onlangs rapporteerden we een nieuwe en veelzijdige etikettering strategie voor SMLM10 waarin eerder gemeld rood-verschoven dimeric (DII)staten van conventionele boor di-pyrometan (BODIPY) vervoeging11,12,13 zijn tijdelijk vormen en worden specifiek opgewonden en gedetecteerd met rood-verschoven golflengten.
BODIPYs zijn veel gebruikte kleurstoffen met honderden varianten die specifiek label sub-cellulaire compartimenten en biomoleculen14,15,16. Vanwege hun gebruiksgemak en toepasbaarheid in levende cellen, zijn BODIPY-varianten commercieel beschikbaar voor conventionele fluorescentiemicroscopie. Hier beschrijven we een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol over hoe de honderden commercieel verkrijgde BODIPY-veren kunnen worden gebruikt voor live-cel SMLM. Door de concentratie van BODIPY monomeren af te stemmen en door de excitatielaserkrachten, beeldvormings- en data-analyseparameters te optimaliseren, worden hoogwaardige superresolutiebeelden en trackinggegevens van één molecuul verkregen in levende cellen. Bij gebruik bij lage concentratie (25-100 nM) kunnen BODIPY-conjugaten gelijktijdig worden gebruikt voor SMLM in het roodverschuivde kanaal en voor correlerende conventionele fluorescentiemicroscopie in het conventionele emissiekanaal. De verkregen gegevens van één molecuul kunnen worden geanalyseerd om de ruimtelijke organisatie van immobiele structuren te kwantificeren en de verspreidingstoestanden van moleculen in levende cellen17te extraheren. De beschikbaarheid van BODIPY-sondes in zowel groene als rode vormen zorgt voor multi-color imaging bij gebruik in de juiste combinatie met andere compatibele fluoroforen.
In dit rapport bieden we een geoptimaliseerd protocol voor het verkrijgen en analyseren van live-cel SMLM-gegevens met behulp van BODIPY-C12, BODIPY (493/503), BODIPY-C12 rood en lysotracker-groen in meerdere kleuren. We lossen vetzuren en neutrale lipiden op in levende gist- en zoogdiercellen met ~ 30 nm resolutie. We tonen verder aan dat gistcellen de ruimtelijke verdeling van extern toegevoegde vetzuren reguleren, afhankelijk van hun metabole toestand. We vinden dat toegevoegde LICHAAMSvetzuren (FA) lokaliseren naar het endoplasmatische reticulum (ER) en lipide druppels (ID’s) onder gevoede omstandigheden, terwijl BODIPY-FAs vormen niet-LD clusters in het plasmamembraan bij het vasten. We breiden de toepassing van deze techniek verder uit naar beeldlysosomen en ID’s in levende zoogdiercellen. Ons geoptimaliseerde protocol voor SMLM met behulp van conventionele BODIPY conjugaten kan een nuttige bron zijn om biologische processen op nanoschaal te bestuderen met de talloze beschikbare BODIPY-vervoeging.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol hebben we aangetoond hoe conventionele BODIPY-conjugaten kunnen worden gebruikt om SMLM-beelden te verkrijgen met een orde van grootteverbetering in ruimtelijke resolutie. Deze methode is gebaseerd op het exploiteren vanII eerder gerapporteerde, rood verschoven D II-toestanden van conventionele LICHAAMSkleurstoffen, die zich tijdelijk vormen door middel van bimoleculaire ontmoetingen. Deze toestanden kunnen specifiek worden opgewekt en gedetecteerd met rood-verschoven golflengten en zijn schaar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health onder awardnummer R21GM127965.
Materials
| BODIPY C12 | ThermoFisher | D3822 | Green fatty acid analog |
| BODIPY C12 Red | ThermoFisher | D3835 | Red fatty acid analog |
| BODIPY(493/503) | ThermoFisher | D3922 | Neutral lipid marker |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2010 | Cell immobilization on glass surface |
| Drop-out Mix Complete w/o nitrogen base | US Biological | D9515 | Amino acids for SCD |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G7021 | Carbon source for SCD |
| Eight Well | Cellvis | C8-1.58-N | Chambered Coverglasses |
| Eight Well, Lb-Tek II | Sigma-Aldrich | Chambered Coverglasses | |
| ET525/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET595/50 | Chroma | Bandpass filter | |
| ET610/75 | Chroma | Bandpass filter | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | Serum |
| FF652 | Semrock | Beam splitter | |
| FF731/137 | Semrock | Bandpass filter | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Cell culture medium |
| Hal4000 | Zhuang Lab, Harvard University | Data acquisition software | |
| Ixon89Ultra DU-897U | Andor | EMCCD camera for photon detection | |
| Laser 405, 488, 561, 640 nm | CW-OBIS | Lasers for excitation | |
| Insight3 | Zhuang Lab, Harvard University | Single molecule localization software | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Amino acid required for cell culture |
| live-cell imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | Imaging buffer |
| Lysotracker Green | ThermoFisher | L7526 | Bodipy based lysosome marker |
| Mammalian ATCC U2OS cells (Manassas, VA) | Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota) | ||
| Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A | Nikon | Oil immersion objective | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140-122 | Antibiotics |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Supplement for cell culture |
| T562lpxr | Chroma | Beam splitter | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Dissociation of adherent cell |
| W303 MATa strain | Horizon-Dharmacon | YSC1058 | Parental yeast strain |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y1250 | Nitrogen base without amino-acids |
| zt405/488/561/640rdc | Chroma | Quadband dichroic mirror | |
References
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).
- Wu, C. -. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), 4077 (2015).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Cordes, T., et al. Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy. Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).
- Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System. ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).
- Yan, Q., et al. Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins. Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).
- Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
- Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology. Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).
- Bröring, M., et al. Bis(BF2)-2,2′-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts. Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).
- Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences. Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).
- Pagano, R. E., Chen, C. S. Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway. Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).
- Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).
- Shim, S. -. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
- Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On. eLife. 7, (2018).
- Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores. PLoS ONE. 13 (10), (2018).
- Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).
- Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), (2017).
- Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Grimm, J. B., et al. A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).
