Очистка фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов в vitro
Summary
Здесь мы представляем метод очищения фибробластов и клеток Шванн от сенсорных и моторных нервов in vitro.
Abstract
Основными клетками периферической нервной системы являются клетки Шванн (СК) и фибробласты. Обе эти клетки отчетливо выражают сенсорные и моторные фенотипы, участвующие в различных моделях экспрессии генов нейротрофического фактора и других биологических процессов, влияющих на регенерацию нервов. В настоящем исследовании установлен протокол для получения высокоочищенных крыс сенсорных и моторных ОВ и фибробластов быстрее. Вентральный корень (моторный нерв) и спинной корень (сенсорный нерв) неонатальных крыс (7-дней) были разобщены и клетки были культивируются в течение 4-5 дней, а затем изоляции сенсорных и моторных фибробластов и SC путем сочетания дифференциального пищеварения и дифференциальных методов последовательно. Результаты иммуноцитохимии и анализа цитометрии потока показали, что чистота сенсорных и моторных ОК и фибробластов составила 90%. Этот протокол может быть использован для получения большого количества сенсорных и моторных фибробластов / SCs быстрее, способствуя исследованию сенсорной и регенерации моторных нервов.
Introduction
В периферической нервной системе нервные волокна в основном состоят из аксонов, клеток Шванн (СК) и фибробластов, а также содержит небольшое количество макрофагов, микрососудистых эндотелиальных клеток и иммунных клеток1. SCs обернуть аксоны в соотношении 1:1 и заключены с помощью слоя соединительной ткани, называемого эндонеуриум. Аксоны затем в комплекте вместе, чтобы сформировать группы, называемые fascicles, и каждая фасцикля завернутый в слой соединительной ткани, известный как промежности. Наконец, все нервное волокно завернуто в слой соединительной ткани, который называется эпинеури. В эндонеуриум, вся популяция клеток состоит из 48% ОК, и значительная часть оставшихся клеток включает фибробласты2. Кроме того, фибробласты являются важными компонентами всех нервных отсеков, включая эпинеуриум, промежную и эндонеуриум3. Многие исследования показали, что ХК и фибробласты играют решающую роль в процессе регенерации после травмы периферического нерва4,,5,,6. После трансекции периферического нерва, проницаемые фибробласты регулируют сортировку клеток через эпирин-B/EphB2 сигнальный путь между ОК и фибробластами, дальнейшее руководство аксональным отрастанием через раны5. Периферические нервные фибробласты выделяют белок тенасцин-С и усиливают миграцию ХК во время регенерации нервов через сигнальный путь71-интегрин. Тем не менее, ТС и фибробласты, используемые в вышеуказанных исследованиях, были получены из седалищного нерва, который включает в себя как сенсорные, так и моторные нервы.
В периферической нервной системе сенсорные нервы (афферентные нервы) проводят сенсорную сигнализацию от рецепторов к центральной нервной системе (ЦНС), в то время как моторные нервы (эфферентные нервы) проводят сигналы от ЦНС к мышцам. Предыдущие исследования показали, что РК выражают различные моторные и сенсорные фенотипы и выделяют нейротрофические факторы для поддержки периферической регенерации нервов8,,9. Согласно недавнему исследованию, фибробласты также выражают различные двигательные и сенсорные фенотипы и влияют на миграцию SCs10. Таким образом, изучение различий между моторными и сенсорными фибробластами нервов/ТС позволяет нам изучать сложные основные молекулярные механизмы периферической регенерации нервов.
В настоящее время существует множество способов очищения ОВ и фибробластов, включая применение антимитических агентов, антител-опосредованного цитолиза11,,12,последовательного иммунопанирования13 и ламинина субстратом14. Однако все вышеперечисленные методы удаляют фибробласты и сохраняют только НК. Высоко очищенные РК и фибробласты могут быть получены с помощью технологии сортировки цитометриипотока 15,но это трудоемкая и дорогостоящая техника. Таким образом, в этом исследовании, простой дифференциальный пищеварения и дифференциального присоединения метод для очистки и изоляции сенсорных и моторных фибробластов нерва и РС был разработан для того, чтобы получить большое количество фибробластов и ОВ быстрее.
Protocol
Representative Results
Discussion
Две основные популяции клеток периферических нервов включали ХК и фибробласты. В первую очередь культивируемые фибробласты и ТЦ могут точно помочь в моделировании физиологии фибробластов и ОК во время развития и регенерации периферических нервов. Исследование показало, что P7 крысины…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (Грант No 2017YFA010104703), Национальным природным фондом Китая (Грант No 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
