Rensing av fibroblaster og Schwann-celler fra sensoriske og motornerver in Vitro
Summary
Her presenterer vi en metode for å rense fibroblaster og Schwann-celler fra sensoriske og motoriske nerver in vitro.
Abstract
Hovedcellene i det perifere nervesystemet er Schwann-cellene (SCs) og fibroblastene. Begge disse cellene uttrykker tydelig sensoriske og motoriske fenotyper involvert i ulike mønstre av nevrotrofisk faktor genuttrykk og andre biologiske prosesser, som påvirker nerveregenerering. Den nåværende studien har etablert en protokoll for å oppnå svært renset rotte sensorisk og motor SCer og fibroblaster raskere. Den ventrale roten (motornerven) og dorsalroten (sensorisk nerve) av nyfødte rotter (7 dager gamle) ble dissosiert og cellene ble dyrket i 4-5 dager, etterfulgt av isolering av sensoriske og motorfibroblaster og SCer ved å kombinere differensial fordøyelse og differensialtilslutningsmetoder sekvensielt. Resultatene av immunocytokjemi og flow cytometri analyser viste at renheten av sensoriske og motoriske SCer og fibroblaster var > 90%. Denne protokollen kan brukes til å oppnå et stort antall sensoriske og motoriske fibroblaster / SCer raskere, noe som bidrar til utforskning av sensorisk og motornerve regenerering.
Introduction
I det perifere nervesystemet består nervefibrene hovedsakelig av aksoner, Schwann-celler (SCer) og fibroblaster, og inneholder også et lite antall makrofager, mikrovaskulære endotelceller og immunceller1. SCs bryte aksoner i en 1: 1 ratio og er omsluttet av en bindevev lag kalt endoneurium. Aksonene er deretter samlet sammen for å danne grupper kalt fascicles, og hver fascicle er pakket inn i et bindevev lag kjent som perineurium. Til slutt er hele nervefiberen pakket inn i et lag med bindevev, som kalles epineurium. I endoneurium består hele cellepopulasjonen av 48% SCer, og en betydelig del av de gjenværende cellene innebærer fibroblaster2. Videre er fibroblaster viktige komponenter i alle nerverom, inkludert epineurium, perineurium og endoneurium3. Mange studier har indikert at SCer og fibroblaster spiller en avgjørende rolle i regenereringsprosessen etter perifere nerveskader4,5,6. Etter transeksjon av perifer nerve, perineurial fibroblasts regulere celle sortering via ephrin-B/EphB2 signalveien mellom SCs og fibroblaster, ytterligere guiding den axonal gjenvekst gjennom sår5. Perifer nerve fibroblaster utskiller tenascin-C protein og forbedre migrering av SCs under nerve regenerering gjennom β1-integrin signalvei7. Imidlertid ble SCs og fibroblaster som brukes i de ovennevnte studiene avledet fra isjiasnerven, som inkluderer både sensoriske og motoriske nerver.
I det perifere nervesystemet utfører sensoriske nerver (afferent nerver) sensorisk signalering fra reseptorene til sentralnervesystemet (CNS), mens motornervene (efferent nerver) utfører signaler fra CNS til musklene. Tidligere studier har indikert at SCs uttrykker distinkte motoriske og sensoriske fenotyper og utskiller nevrotrofiske faktorer for å støtte perifer nerveregenerering8,9. Ifølge en nylig studie, fibroblaster også uttrykke ulike motoriske og sensoriske fenotyper og påvirke migrering av SCs10. Dermed gjør utforskning av forskjeller mellom motoriske og sensoriske nervefibroblaster / SCer oss til å studere de kompliserte underliggende molekylære mekanismene for perifer nervespesifikk regenerering.
I dag er det mange måter å rense SCs og fibroblaster, inkludert anvendelse av antimitotiske midler, antistoffmediert cytolyse11,,12,sekvensiell immunopanning13 og laminin substratum14. Men alle de ovennevnte metodene fjerner fibroblaster og bevarer bare SCs. Høyt renset SCs og fibroblaster kan oppnås ved strømningscytometrisorteringsteknologi15, men det er en tidkrevende og kostbar teknikk. Derfor, i denne studien, en enkel differensial fordøyelse og differensial etterlevelse metode for rensing og isolere sensorisk og motor nerve fibroblaster og SCs ble utviklet for å få et stort antall fibroblaster og SCs raskere.
Protocol
Representative Results
Discussion
De to store cellepopulasjonene av perifere nerver inkluderte SCer og fibroblaster. De primært kultiverte fibroblaster og SCer kan nøyaktig bidra til å modellere fysiologien til fibroblaster og SCer under perifer nerveutvikling og regenerering. Studien viste at P7 rotte isjias nerveceller inneholdt ca 85% av S100-positive SCs, 13% av OX7-positive fibroblaster og bare 1,5% av OX42-positive makrofager13. Selv om antall fibroblaster er mindre enn SCs, den første spredningshastigheten av fibroblast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
