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Preferenza per il saccarosio e test di ipofagia indotti dalla novità nei ratti utilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/60953
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,4, 1,3
1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Department for Psychosomatic Medicine, Charité-Universitätsmedizin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin and Berlin Institute of Health, 2Department of Internal Medicine, Helios Clinic, 3Department of Psychosomatic Medicine and Psychotherapy, University Hospital Tübingen, 4Department of Quantitative Health Sciences, University of Massachusetts Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Presentato qui è un protocollo per studiare il comportamento depressionico e anedonico nei ratti. Combina due metodi comportamentali consolidati, la preferenza per il saccarosio e i test di ipofagia indotti dalla novità, con un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo e liquidi, per indagare indirettamente il comportamento dei roditori utilizzando parametri surrogati.

Abstract

La prevalenza e l'incidenza dei disturbi depressivi sono in aumento in tutto il mondo, colpendo circa 322 milioni di individui, sottolineando la necessità di studi comportamentali nei modelli animali. In questo protocollo, per studiare il comportamento depressionico e anedonico nei ratti, la preferenza consolidata per il saccarosio e i test di ipofagia indotti dalla novità sono combinati con un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo e liquidi. Prima del test, nel paradigma delle preferenze del saccarosio, i ratti maschi vengono addestrati per almeno 2 giorni a consumare una soluzione di saccarosio oltre all'acqua del rubinetto. Durante la prova, i ratti sono nuovamente esposti alla soluzione di acqua e saccarosio. Il consumo viene registrato ogni secondo dal sistema automatizzato. Il rapporto tra saccarosio e assunzione totale di acqua (rapporto preferenza saccarosio) è un parametro surrogato per l'anedonia. Nel test di ipofagia indotto dalla novità, i ratti maschi subiscono un periodo di allenamento in cui sono esposti a uno spuntino appetibile. Durante l'allenamento, i roditori mostrano un apporto stabile di snack di base. Il giorno del test, gli animali vengono trasferiti dalle gabbie di casa in una gabbia fresca e vuota che rappresenta un nuovo ambiente sconosciuto con accesso al noto spuntino appetibile. Il sistema automatizzato registra l'assunzione totale e la sua microstruttura sottostante (ad esempio, latenza ad avvicinarsi allo spuntino), fornendo informazioni sui comportamenti anedonici e ansiosi. La combinazione di questi paradigmi con un sistema di misurazione automatizzato fornisce informazioni più dettagliate, insieme a una maggiore precisione riducendo gli errori di misurazione. Tuttavia, i test utilizzano parametri surrogati e rappresentano solo depressione e anedonia in modo indiretto.

Introduction

In media, il 4,4% della popolazione mondiale è colpito dalla depressione. Questi rappresentano 322 milioni di persone in tutto il mondo, con un aumento del 18% rispetto a dieci anni fa1. Secondo le stime dell'Organizzazione Mondiale della Sanità, la depressione sarà al secondo posto nella classifica degli anni di vita corretti per la disabilità nel 20202. Per affrontare la crescente prevalenza di disturbi affettivi e stabilire nuove strategie interventive, è necessario studiare ulteriormente questo comportamento. Prima e oltre all'esame nell'uomo, sono necessari studi sugli animali.

Diversi modelli sono stati stabiliti per studiare componenti del comportamento depressivo (ad esempio, test di nuoto forzato, test di sospensione della coda, test di preferenza del saccarosio e ipofagia indotta dalla novità)3,4. Il test di preferenza del saccarosio (SPT) e l'ipofagia indotta dalla novità (NIH) possono rilevare comportamenti simili alla depressione negli animali. Questi test stessi non inducono uno stato di depressione nei roditori ma descrivono cambiamenti acuti nel comportamento. Sia il TSS che il NIH valutano un tratto caratteristico di depressione noto come anedonia, che è la perdita di interesse per quanto segue: attività gratificanti, attività che un tempo eranogodute dai singoli 5,e un aspetto del complesso fenomeno della lavorazione e risposta allaricompensa 6. Entrambi i test studiano la risposta a uno stimolo gratificante sotto forma di cibo appetibile. L'entità del consumo funge da parametro surrogato per l'anedonia7,8,9.

Il valore delle prove che studiano l'anedonia dipende fortemente dall'accurata determinazione del consumo risultante da una misurazione precisa del peso della sostanza. Convenzionalmente, questa misurazione viene effettuata manualmente una volta prima e una volta dopo il test. Tuttavia, questo è soggetto a misurazioni errate per diversi motivi. In primo luogo, i roditori tendono ad accumulare cibo, il che significa che rimuovono il cibo senza consumarlo immediatamente, quindi lo nascondono in un luogo sicuro. Pertanto, questa perdita di cibo può essere inclusa nel calcolo del consumo totale. In secondo luogo, i ratti versano cibo e acqua, con conseguente perdita di peso senza il rispettivo consumo. In terzo luogo, la perdita involontaria di liquido si verifica a causa della manipolazione delle bottiglie inserendole e rimuovendole dalle gabbie.

In un approccio per ridurre queste fonti di errore, abbiamo combinato i due test comuni di valutazione dell'anedonia (SPT3,4 e NIH9)con la misurazione dell'assunzione di cibo e acqua utilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di alimenti e liquidi. Questa procedura consente un'indagine accurata sul consumo di sostanze appetibili e fornisce informazioni sull'esperienza del piacere nei ratti come caratteristica del comportamento simile alla depressione. Gli errori di cui sopra associati alla misurazione manuale sono ridotti utilizzando diversi approcci, che vengono illustrati più avanti in modo più dettagliato.

Per fornire informazioni sulla microstruttura, il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione utilizzato inquesto protocollo 10 pesa il cibo (±0,01 g) ogni secondo. Pertanto, un peso stabile è documentato come "non mangiare", e un peso instabile come "mangiare". Un "incontro" è definito come cambiamento di peso stabile prima e dopo un evento. Un pasto consiste in uno o più incontri e la sua dimensione minima nei ratti è stata definita come 0,01 g. Un pasto è separato da un altro pasto nei ratti di 15 min (valore standardizzato). Pertanto, l'assunzione di cibo è considerata un pasto quando gli attacchi si sono verificati entro 15 minuti e il cambiamento di peso è uguale o superiore a 0,01 g. I parametri dei pasti valutati in questo protocollo includono la durata del pasto, il tempo trascorso nei pasti, la dimensione dell'incontro, la durata dell'incontro, il tempo trascorso negli incontri, la latenza al primo incontro e il numero di incontri.

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Protocol

La cura degli animali e le procedure sperimentali hanno seguito le specifiche linee guida etiche istituzionali ed è stata approvata dall'autorità statale per la ricerca sugli animali.

1. Funzionamento del sistema di monitoraggio automatizzato

NOTA: quando si gestisce il sistema di monitoraggio automatico, è fondamentale documentare ogni azione nella casella dei commenti inclusa nel software immediatamente prima dell'azione. La descrizione deve essere digitata nella casella dei commenti e premendo Salva, viene salvata con un punto di tempo specifico. I punti di tempo sono significativi quando si analizzano i dati, poiché il sistema registra continuamente e il periodo di interesse deve essere indicato per l'analisi.

  1. Installazione, utilizzo e manutenzione del sistema di monitoraggio automatizzato
    NOTA: Questo protocollo utilizza ratti Sprague Dawley maschi adulti del peso di 250-300 g (~ 10 settimane). Si consiglia di ospitare ratti in gruppi durante il periodo di acclimatazione. Le condizioni ambientali devono essere controllate con i seguenti parametri: 12 h/12 h ciclo buio/luce con luci accese alle 6:00 A.M., umidità del 45%-65%, e temperatura di 21-23 °C, e accesso ad libitum all'acqua e dieta standard dei roditori. La manipolazione quotidiana consente agli animali di abituarsi agli investigatori.
    1. Separare i ratti in modo che ogni animale abbia una gabbia individuale. Assicurarsi che ogni topo rimanga separato durante il protocollo.
    2. Riempire le gabbie di alloggiamento con biancheria da letto regolare con uno strato spesso 1-2 cm. Questa quantità (ridotta) riduce la possibilità di contaminazione di microbilanciamenti e tramogge con fuoriuscite, riducendo così gli errori di misurazione. Aggiungere tubi di plastica (ad esempio, un pezzo lungo 20 cm di un tubo di scarico di plastica con diametro di 8 cm) e rosicchiare il legno come arricchimento, omettendo i tessuti di carta per ridurre gli errori di misurazione.
    3. Preparare le gabbie per la misurazione automatizzata dell'assunzione di alimenti solidi e liquidi collegando due supporti a gabbia chiusi con microbilanciamenti a fori su misura sul lato anteriore delle gabbie. Posizionare due tramogge vuote sui supporti della gabbia, una per il chow e una per la bottiglia.
      NOTA: I microbilanciamenti sono collegati tramite cavi a un sistema di registrazione collegato a un computer e il rispettivo software è installato sul computer.
    4. Per iniziare la registrazione, aprite "Monitor" e premete "Start", quindi scegliete un posto dove salvare i dati.
    5. Utilizzando la funzione dicalibrazione(pressa " Calibrate ") del sistema di monitoraggio automatico dell'aspirazione, calibrare ogni bilanciamento rimuovendo le tramogge e posizionando due diversi pesi misurati sui supporti della gabbia con balancei.i. Eseguire questa attività a intervalli di tempo regolari (si consiglia settimanalmente).
    6. Riempire completamente una tramoggia con chow (~ 100 g) e rimuovere i pezzi di chow e i sbriciolamenti di dimensioni troppo piccole. Riempire l'acqua nella bottiglia (~ 100 mL) e posizionarla nell'altra tramoggia.
    7. Documentare la posizione del cibo e dell'acqua (ad esempio, equilibrio 1: animale alimentare 1, bilancio 2: animale d'acqua 1).
    8. Metti il topo nella gabbia e apri tutti i cancelli dei supporti della gabbia in modo che possa mangiare e bere ad libitum.
      NOTA: Per una misurazione accurata, è necessario mantenere quotidianamente gli equilibri e le tramogge pulendo delicatamente con un pennello dallo sversamento e rimuovendo piccole briciole di cibo dal contenitore alimentare. Ciò ridurrà notevolmente la misurazione errata. Chiudere tutti i cancelli durante la manutenzione giornaliera.
  2. Accesso ai dati dopo gli esperimenti
    1. Cercare nella casella dei commenti i punti di ora di inizio e fine di un periodo (ad esempio, allenamento, test) che deve essere analizzato.
    2. Fare clic su "Visualizzadati " sul software per aprire il Visualizzatore dati.
    3. Inserire i punti di tempo nelle caselle sotto "Begin time" e "End time". Premere il quadrato nell'angolo superiore sinistro indicando il saldo che ha registrato le informazioni.
    4. Clicca su "PSC Totals" per accedere ai dati della microstruttura. Premere il pulsante "Esporta tabella PSC" per esportare i dati.
      NOTA: Per confrontare la microstruttura dei singoli animali (ad esempio, non stressati vs stressati) utilizzando il monitoraggio automatizzato, i singoli animali possono essere selezionati nel"Visualizzatore dati" premendo il quadrato appropriato nell'angolo superiore sinistro. Il PSC Totals mostra solo la microstruttura per l'animale selezionato. L'analisi statistica non può essere eseguita con il sistema. I dati devono essere estratti in un programma di fogli di calcolo / software di analisi.

2. Attuazione della prova di preferenza per il saccarosio

  1. Condurre il periodo di formazione
    NOTA: Prima della prova, gli animali devono essere abituati alla disponibilità di due bottiglie per liquidi sulle tramogge attraverso i cancelli, mentre il cibo deve essere fornito dalla parte superiore delle gabbie (l'allevamento è mostrato nella figura 1). Questo periodo di formazione dovrebbe durare almeno 2 giorni. Viene eseguito nelle gabbie di casa nella stanza in cui sono tenuti gli animali.
    1. Chiudi tutti i cancelli. Rimuovere la bottiglia d'acqua e il contenitore del cibo dai microbilanciamenti.
    2. Posizionare il cibo pre-pesato (~ 50 g) sulla parte superiore della gabbia e documentare il suo peso ogni giorno utilizzando un equilibrio regolare per valutare il consumo giornaliero di cibo. Ricarica, se necessario.
    3. Pulire una bottiglia con acqua limpida e ricaricare con circa 100 ml di acqua. Riposizionare sulla tramoggia.
    4. Riempire una seconda bottiglia pulita con 100 ml di soluzione di saccarosio all'1% appena fatta. Mettilo sulla tramoggia.
      NOTA: Contrassegnare accuratamente le bottiglie e documentarne la posizione (ad esempio, equilibrio 1: animale da acqua 1, equilibrio 2: soluzione di saccarosio animale 1).
    5. Aprite tutti i cancelli. Documentare l'inizio della formazione nel sistema di monitoraggio. Lasciare i cancelli aperti per 24 ore, con conseguente accesso ad libitum ad entrambe le bottiglie. Dopo 24 ore, chiudere i cancelli e documentare la fine dell'allenamento. I dati dell'intervallo di 24 ore possono essere valutati utilizzando il sistema di monitoraggio automatizzato inserendo l' "ora di inizio" e l' " ora difine". Le procedure sono le stesse quando viene valutato un intervallo di prova di 1 h.
    6. Pulire e ricaricare le bottiglie ogni 24 ore. Preparare ogni giorno una soluzione fresca di saccarosio all'1%. Cambiare la posizione della bottiglia di soluzione di acqua e saccarosio ogni giorno per evitare effetti di assuazione.
      NOTA: Condurre l'allenamento in tutti gli animali almeno 48 ore fino a quando i rapporti di preferenza raggiungono ~1. Il rapporto di preferenza del saccarosio viene valutato direttamente dopo l'allenamento utilizzando il "Visualizzatore dati". È calcolato come rapporto tra l'assunzione di saccarosio e l'assunzione globale (acqua più assunzione di saccarosio).
    7. 24 ore prima della prova, rimuovere la bottiglia con la soluzione di saccarosio in modo che il ratto abbia accesso solo al chow standard e all'acqua.
    8. Preparare una bottiglia fresca riempita con acqua di rubinetto e una riempita con una soluzione di saccarosio all'1%, entrambe con ~ 100 ml.
    9. Prima del test, chiudi tutti i cancelli.
    10. Rimuovere la bottiglia riempita con acqua di rubinetto dalla tramoggia e posizionare le due bottiglie fresche, una riempita con acqua di rubinetto e una riempita con una soluzione di saccarosio all'1%, sulla tramoggia.
    11. Aprire tutti i cancelli, documentare l'inizio del test nel sistema di monitoraggio. Lasciare i cancelli aperti per 60 minuti. Chiudere i cancelli dopo 60 minuti e documentare la fine della prova.
    12. Valutare i dati (ad esempio, il rapporto di assunzione di saccarosio/fluido totale).
      NOTA: Il test può essere ripetuto più volte con intervalli di allenamento (almeno 2 giorni) nel mezzo.

3. Implementazione del test di ipofagia indotta dalla novità

  1. Condurre il periodo di formazione
    NOTA: Prima della prova, si raccomanda un periodo di allenamento giornaliero di 30 minuti di 5 giorni (l'configurazione è illustrata nella figura 2). L'obiettivo è quello di raggiungere una linea di base stabile per l'assunzione di snack appetibili prima dell'esperimento. Viene eseguito nelle gabbie di casa nella stanza in cui sono tenuti gli animali.
    1. Chiudere tutti i cancelli e rimuovere la tramoggia con chow standard.
    2. Riempi una tramoggia fresca con lo spuntino appetibile (~ 50 g). Inserire accuratamente i cracker nella tramoggia per evitare il crollo. Posizionare la tramoggia sul supporto della gabbia sopra il microbilanciamento.
    3. Aprire i cancelli per 30 minuti in modo che il topo abbia accesso ad libitum allo spuntino e all'acqua. Documentare l'inizio della formazione nel sistema di monitoraggio.
      NOTA: Il ratto non deve avere accesso al chow standard durante il periodo di allenamento.
    4. Chiudere i cancelli dopo 30 minuti e documentare la fine dell'allenamento nel sistema di monitoraggio. Sostituire lo spuntino con un chow standard.
    5. Ripetere questa dose giornaliera fino a ottenere un'assunzione stabile di snack appetibili di base (ad esempio, 1,5-2,0 g/30 min) e 2) l'assunzione non differisce statisticamente tra i giorni di allenamento.
  2. Esecuzione del test di ipofagia indotta dalla novità
    1. Preparare una gabbia vuota e appena pulita senza lettiera o arricchimento collegata al sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo. Posiziona una tramoggia con una bottiglia di acqua del rubinetto e tramoggia con uno spuntino appetibile sui supporti della gabbia.
      NOTA: La nuova gabbia deve essere collocata nella stessa stanza in cui sono tenuti i ratti e deve essere condotta una formazione. Tieni i cancelli chiusi.
    2. Rimuovere il topo dalla gabbia di casa e posizionare nella nuova gabbia.
    3. Apri tutti i cancelli per 30 minuti. Documentare l'inizio dei test nel sistema di monitoraggio.
      NOTA: Durante i 30 minuti di accesso allo spuntino, le dimensioni dell'assunzione di snack e i parametri di microstruttura sottostanti (ad esempio, latenza al primo pasto) vengono registrati utilizzando il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo.
    4. Chiudere i cancelli dopo 30 minuti e documentare la fine dei test. Riposizionare il topo nella gabbia di casa.
      NOTA: La prova può essere ripetuta più volte con intervalli di allenamento (almeno 5 giorni) nel mezzo.

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Representative Results

Per testare la distribuzione dei dati, è stato utilizzato il test di Kolmogorov-Smirnov. I test T sono stati utilizzati quando i dati sono stati normalmente distribuiti e il test Mann-Whitney-U è stato utilizzato, in caso di allora. ANOVA uni-way seguito da Tukey post-hoc test è stato utilizzato per il confronto di più gruppi normalmente distribuito. ANOVA uni-way seguito dal test di confronto multiplo di Dunn è stato utilizzato in casi di distribuzione non normale. Le differenze tra i gruppi sono state considerate significative quando p < 0,05.

Il TSS è stato eseguito su ratti ingenui in questo studio. Il consumo di soluzione di saccarosio è aumentato e l'assunzione di acqua è diminuita durante il periodo di formazione(figura 3). Il primo giorno di addestramento, i ratti hanno bevuto 24,40 mL ± 3,48 mL di soluzione di saccarosio(figura 3A)e 4,83 mL ± 0,89 mL di acquaregolare (figura 3B),producendo un rapporto di preferenza per il saccarosio di 0,80 ± 0,06 (figura 3C). Il secondo giorno di formazione, i ratti hanno aumentato il consumo di soluzione di saccarosio fino a 33,77 mL ± 4,49 mL (non significativo, p = 0,17 vs. giorno 1) e riduzione dell'assunzione di acqua a 0,42 mL ± 0,13 mL (p < 0,001 vs. giorno 1), con un rapporto di 0,99 ± 0,004 (p < 0,05 vs. giorno 1; Figura 3C). Otto ratti sono stati studiati qui; pertanto, ogni punto dati è derivato da otto animali. L'assunzione di liquidi, compresa la sua microstruttura, è stata registrata automaticamente. I dati sono stati estratti da totali PSC utilizzando il visualizzatore dati.

Durante le prove di 60 minuti, gli animali hanno consumato tra 0 e 6,18 mL di soluzione di saccarosio con un valore medio di 2,91 mL ± 0,66 (n =8) senza consumare acqua, con un rapporto di preferenza per il saccarosio di 0,99 ± 0,00. Gli animali che non hanno consumato alcun liquido durante il test sono stati esclusi dall'analisi. Sono stati studiati otto ratti. L'assunzione di liquidi è stata registrata automaticamente.

Il sistema automatizzato di monitoraggio delle assunzioni ha fornito dati sulla microstruttura di assunzione di saccarosio valutata automaticamente durante le prove, che sono stati estratti da PSC Totals utilizzando il visualizzatore dati. Questi parametri erano la dimensione dei pasti(figura 4A),la durata dei pasti(figura 4B),il tempo trascorso nei pasti in secondi(figura 4C)e le percentuali(figura 4D),la frequenza dei pasti(figura 4E),la latenza al primo pasto(figura 4F),intervallo inter-pasto(Figura 4G),tasso di consumo(Figura 4H),durata dell'incontro(Figura 4I),dimensione dell'incontro (Figura 4J) e tempo trascorso in attacchi in secondi(figura 4K) e percentuali(figura 4L).

Per studiare ulteriormente i vantaggi del sistema automatizzato di monitoraggio delle assunzioni, i dati sopra illustrati sono stati confrontati con i dati ottenuti utilizzando valutazioni manuali convenzionali (pesatura manuale delle bottiglie prima e dopo il periodo di formazione/prova, tabella 1). Il primo giorno di allenamento, il saccarosio(p < 0,01) e l'assunzione di acqua(p < 0,01) erano significativamente più elevati se valutati manualmente rispetto a quello automatico. Il secondo giorno di allenamento, l'assunzione diacqua (p < 0,001) e il rapporto di preferenza per il saccarosio(p < 0,01) differivano tra i due gruppi e durante le prove. Tutti i parametri, vale a dire l'assunzione disaccarosio (p < 0,001),l'assunzione di acqua (p < 0,001) e il rapporto di preferenza per il saccarosio(p < 0,001) erano diversi tra i gruppi, probabilmente a causa di misurazioni o fuoriuscite erroneamente elevate se valutate manualmente.

L'assunzione complessiva dello spuntino appetibile durante l'allenamento è costantemente aumentata: 0,48 g ± 0,14 g (giorno 1), 1,05 g ± 0,32 g (giorno 2), 1,48 g ± 0 56 g (giorno 3), 1,1 g ± 0,39 g (giorno 4) e 1,91 g ± 0,68 g (giorno 5), indicando un adattamento durante i primi 2-3 giorni. Analogamente, le dimensioni dei pasti tendevano ad aumentare tra i giorni di formazione(figura 5A, p = 0,12), mentre la durata dei pasti(figura 5B)non lo faceva (p > 0,05). Allo stesso modo, altri parametri microstrutturali come il tempo trascorso nei pasti(Figura 5C),la latenza al primo attacco(Figura 5D),la dimensione dell'attacco(Figura 5E),la durata dell'incontro (Figura 5F), il tempo trascorso negli incontri(Figura 5G) e il numero di incontri (Figura 5H) non erano significativamente diversi tra questi giorni (p > 0.05). Sono stati studiati otto ratti; pertanto, ogni punto dati è derivato da otto animali. L'assunzione di snack, compresa la microstruttura, è stata registrata automaticamente. I dati sono stati estratti da totali PSC utilizzando il visualizzatore dati.

Il giorno della prova, ratti ingenui esposti allo spuntino in un ambiente nuovo hanno mostrato un'assunzione dello spuntino appetibile di 0,98 g ± 0,34 g(figura 6A). I parametri della microstruttura di assunzione di cibo nel giorno della prova, compresa la durata del pasto (Figura 6B), il tempo trascorso nei pasti(Figura 6C),la latenza al primo attacco(Figura 6D),la dimensione dell'attacco(Figura 6E),la durata dell'attacco (Figura 6F), il tempo trascorso negli attacchi (Figura 6G) e il numero di attacchi(Figura 6H), sono stati valutati automaticamente ed estratti da totali PSC utilizzando il visualizzatore dati.

Per studiare la specificità del test di ipofagia indotta dalla novità, i dati sopra descritti da ratti ingenui e non stressati sono stati confrontati con quelli che hanno ricevuto un'iniezione intracerebroventricolare del fattore di rilascio della corticotropina, che stimola l'asse di stress ipotalamo-ipofisi-surrenale e induce stress e ansia11. I dati individuali per ogni animale sono stati ottenuti utilizzando il "Visualizzatore dati" e "PSC Totals", come descritto nella sezione del protocollo. I singoli dati sono stati quindi assemblati in base ai gruppi in un programma di fogli di calcolo e analizzati per differenze statistiche. È stata rilevata una differenza significativa nelle dimensioni deipasti (p < 0,01) e nella dimensione dell'attacco (p < 0,01) tra entrambi i gruppi(tabella 2). La differenza nelle dimensioni dell'attacco non sarebbe stata rilevabile utilizzando la valutazione manuale.

Figure 1
Figura 1: Configurazione della prova di preferenza per il saccarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Creazione di una prova di ipofagia indotta dalla novità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Periodo di formazione per la prova di preferenza del saccarosio. Il consumo di soluzione di saccarosio (A) e acqua (B) è stato valutato su 24 ore per 2 giorni. Il rapporto di preferenza per il saccarosio(C)è stato calcolato di conseguenza. I dati sono presentati come ± SEM da otto ratti (*p < 0,05, ***p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Prova di preferenza del saccarosio. Il giorno del test, la microstruttura di assunzione di liquidi (qui, per quanto riguarda l'assunzione di saccarosio, è stata analizzata oltre 1 h per le dimensioni complesse dei pasti(A),la durata dei pasti(B),il tempo trascorso nei pasti ins( C ), il tempo trascorso nei pasti in % (D), il numero di pasti (E), la latenza al primo pasto (F), l'intervallo tra i pasti(G),il tasso di alcol (H), la durata dell'incontro(I), la dimensione dell'incontro(J),il tempo trascorso negli incontri in s (K) e il tempo trascorso negli attacchi in % (L). I dati sono presentati come ± SEM, n = 8 ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Periodo di formazione per la prova di ipofagia indotta dalla novità. Le dimensioni dei pasti(A),la durata delpasto (B),il tempo trascorso nei pasti in s (C), la latenza al primo incontro (D), la dimensione dell'incontro(E),la durata dell'incontro(F),il tempo trascorso negli incontri(G)e il numero di incontri (H) sono stati valutati per un periodo di 5 giorni. I dati sono presentati come ± SEM, n = 8 ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Test dell'ipofagia indotta dalla novità. Il giorno del test, la microstruttura di assunzione di cibo è stata analizzata su 1 h per le dimensioni del pasto comprendenti (A), la durata del pasto (B), il tempo trascorso nei pasti (C), la latenza al primo attacco (D), la dimensione dell'incontro (E), la durata dell'incontro (F), il tempo trascorso negli incontri (G) e il numero di incontri (H). I dati sono presentati come ± SEM, n = 8 ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro Valutazione manuale Monitoraggio automatico delle assunzioni
Periodo di formazione (giorno 1)
Assunzione di saccarosio (ml) 63.46 ± 10.2 24.4 ± 3.48**
Inakte d'acqua (ml) 12,07 ± 1,62 4.83 ± 0.89**
Rapporto preferenze saccarosio 0,83 ± 0,03 0,8 ± 0,06
Periodo di formazione (giorno 2)
Assunzione di saccarosio (ml) 45,49 ± 5,75 33.77 ± 4.49
Inakte d'acqua (ml) 4,92 ± 0,80 0,42 ± 0,13***
Rapporto preferenze saccarosio 0,89 ± 0,02 0,99 ± 0,004**
Prova di preferenza del saccarosio
Assunzione di saccarosio (ml) 10.15 ± 0,53 2.91 ± 0.66****
Inakte d'acqua (ml) 6.65 ± 0,68 0 ***
Rapporto preferenze saccarosio 0,61 ± 0,04 0,99 ± 0,001***

Tabella 1: Prova di preferenza del saccarosio nei ratti ingenui mediante valutazione manuale rispetto al sistema automatizzato di monitoraggio delle assunzioni. La distribuzione dei dati è stata determinata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. I dati sono espressi come media ± SEM e le differenze sono state analizzate utilizzando test t o il test Mann-Whitney U a seconda della distribuzione dei dati (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. valutazione manuale). 

Parametro Unstressed stressato
(n=8) (n=11)
Dimensioni dei pasti (g/300g bw) 0,98 ± 0,29 0,35 ± 0,07**
Durata del pasto (sec) 998.29 ± 163.87 1209.11 ± 114.67
Tempo trascorso nei pasti (sec) 998.29 ± 163.87 989.27 ± 174.73
Tempo trascorso nei pasti (%) 55.46± 9.10 54.96 ± 9.71
Latenza al primo attacco (sec) 241.25 ± 45.96 185.50 ± 57.52
Dimensione attacco (g) 0,21 ± 0,03 0,08 ± 0,01**
Durata attacco (sec) 70.70 ± 14.12 45.59 ± 4.20
Tempo trascorso in incontri (sec) 439,75 ± 125,94 208.73 ± 45.01
Tempo trascorso negli incontri (%) 24.43 ± 7.00 11.6 ± 2.50
Incontri (numero) 5.63 ± 0,67 4.64 ± 0,80

Tabella 2: Prova di ipofagia indotta dalla novità in ratti ingenui non stressati e stressati (iniettati da CRF). Nel gruppo di stress, i ratti icv-cannulati sono stati iniettati con CRF da 0,6 μg/5 μL e successivamente sottoposti a ipofagia indotta dalla novità. La distribuzione dei dati è stata determinata utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Le differenze sono state analizzate utilizzando test t o il test Mann-Whitney U a seconda della distribuzione dei dati. Per una migliore comparabilità, tutti i dati sono espressi come ± SEM (**p < 0,01 vsvs . non stressato).

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Discussion

La preferenza per il saccarosio e le prove di ipofagia indotte dalla novità sono due tecniche consolidate per valutare l'anedonia nei ratti. La loro combinazione con il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo consente un'analisi più dettagliata nei ratti indisturbati e riduce la misurazione errata.

L'incidenza degli errori è ridotta da approcci diversi. In primo luogo, per affrontare l'errore che si verifica a causa dello sversamento, lo spazio tra la tramoggia e il cancello del cibo consente alle briciole generate durante la rosicchiatura di cadere sul vassoio integrato. Raccogliendo questa fuoriuscita sui supporti della gabbia, sono inclusi nella misurazione (poiché lo sversamento è ancora in equilibrio, non influisce sulla misurazione). In secondo luogo, per prevenire l'accaparramento, l'apertura del supporto della gabbia per topi è abbastanza grande da consentire all'animale di mangiare dalla tramoggia del cibo con la testa all'interno dell'apertura, ma abbastanza piccola da limitare la capacità dell'animale di usare le mani mentre mangia. Questo limita la loro capacità di rimuovere il cibo e portarlo nella gabbia.

In terzo luogo, il sistema riduce la perdita involontaria di liquido perché la bottiglia liquida, dopo l'adescamento, non perde e l'evaporazione avviene solo lentamente (approssimativamente <10 mg/h) all'interfaccia di precisione della sfera/tubo del setaccio in acciaio inossidabile. Inoltre, poiché il sistema pesa automaticamente le bottiglie, la manipolazione delle bottiglie durante la registrazione non è necessaria, il che è una causa comune di errori. Si sospetta che le differenze osservate nel confronto tra misurazioni manuali eautomatizzate (tabella 1) siano dovute a perdite involontarie durante la manipolazione manuale delle bottiglie.

L'uso del sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo offre diversi vantaggi, come l'analisi dettagliata dell'assunzione di alimenti solidi e liquidi e la valutazione della microstruttura di assunzione alimentaresottostante 10. Il termine "microstruttura" descrive il modello di assunzione di cibo o fluidi in modo più dettagliato. Negli studi senza un sistema automatizzato di monitoraggio delle assunzioni, l'assunzione viene misurata pesando cibo/fluido all'inizio e alla fine di un punto di interesse. L'unica informazione acquisita da questo approccio è il consumo totale per un certo periodo di tempo.

Al contrario, il sistema di monitoraggio automatizzato fornisce maggiori informazioni sui consumi durante questo periodo, perché registra variazioni di peso dei microbilanciamenti ogni secondo. Le registrazioni possono dettagliare quando il roditore inizia a mangiare, quanto spesso mangia, per quanto tempo mangia, quanto mangia, quanto durano le pause tra mangiare, ecc. Per ottenere dati simili al sistema automatizzato utilizzando la misurazione manuale, gli utenti dovrebbero misurare frequentemente il contenuto durante i test /allenamenti e quindi disturbare significativamente gli animali. Con il sistema automatizzato, i roditori rimangono indisturbati durante le sessioni di allenamento e i test.

Considerando il gran numero di sistemi di aspirazione automatizzati disponibili per i roditori, è importante notare che non è richiesto alcun modello specificato per il protocollo qui descritto. Tuttavia, questo sistema è molto sensibile. Per evitare errori dovuti al rumore ambientale (vibrazioni a basso livello o scuotimento della massa sulla scala), l'algoritmo del sistema valuta i valori raccolti in base al secondo e accetta solo quelli che sono al di sotto di un set point per il "rumore" al fine di raggiungere una media di 10 valori. Se il sistema supera questa soglia di rumore, i valori non vengono utilizzati per calcolare pesi stabili, che vengono utilizzati per calcolare gli attacchi di alimentazione.

Per quanto riguarda l'esecuzione delle prove, è necessario tenere presenti diversi punti critici. Tutti i test comportamentali devono essere eseguiti alla stessa ora del giorno, poiché le alterazioni circadiane possono influenzare ilcomportamento degli animali 12,13. La maggior parte degli studi esegue test comportamentali durante la fase di luce, mentre qui, tutti i test sono stati eseguiti durante la fase buia. I roditori sono animali notturni e quindi attivi nella fase buia, mentre dormono omeno attivi 12 con minore attività esplorativa13 durante la fase di luce. Pertanto, i test comportamentali sono più fisiologicamente appriopriati durante il periodo delle foto scure.

È importante notare che per la prova di preferenza del saccarosio sono state utilizzate diverse concentrazioni della soluzione di saccarosio, che vanno dallo 0,5% al 10%4,7,14. Sono scelti principalmente a seconda della specie, del ceppo, del sesso e dell'età, ma soprattutto in base al comportamento di bere osservato durante l'allenamento (tutti gli animali dovrebbero bere approssimativamente la stessa quantità prima del trattamento / intervento). Tuttavia, alte concentrazioni (ad esempio, il 10 %) può ignorare l'anedonia, dal momento che anche gli animali con comportamento simile alla depressione bevono ancora liquidi moltodolci 4.

Inoltre, l'elevato contenuto calorico dovuto ad alte concentrazioni può influire in modo più evidente sulla preferenza per la soluzione di saccarosio. Pertanto, per questo protocollo è stata scelta una soluzione di saccarosio dell'1%. Alcuni studi raccomandano l'uso di saccarina al posto delsaccarosio 15 per evitare qualsiasi influenza calorica. Tuttavia, il tenore calorico medio della quantità consumata di soluzione di saccarosio % (2 g di soluzione di saccarosio all'1% contiene 0,08 kcal) è notevolmente inferiore a quello della stessa quantità di chow standard (2 g contiene 7,8 kcal). Pertanto, questo punto sembra secondario.

È anche importante notare che il rapporto di preferenza per il saccarosio di base qui valutato utilizzando il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo è più elevato (0,99) rispetto a studi precedenti che utilizzano una valutazione manuale (con 0,7 neitopi 8,0,8 nei ratti giovani adulti, 0,6 nei ratti maschi di Sprague Dawleyinvecchiati 16). Ciò può essere dovuto alla manipolazione delle bottiglie, poiché la pesatura convenzionale probabilmente causa la perdita di liquido durante l'inserimento e la rimozione dalle gabbie. Ciò è ulteriormente corroborato dai risultati riportati nella tabella 1. Pertanto, l'uso del sistema di monitoraggio automatizzato può essere più adatto per rilevare l'anedonia, mentre un'ulteriore stimolazione degli aspetti edonici dell'assunzione di cibo può essere persa a causa di effetti sul soffitto.

Per quanto riguarda il test di ipofagia indotto dalla novità, è fondamentale consentire ai ratti di sviluppare una linea di base stabile per l'assunzione dello spuntino appetibile prima di eseguire il test. Solo quando si raggiunge una linea di base stabile all'interno e tra i ratti deve essere eseguita la prova effettiva. In caso contrario, gli effetti dell'intervento (ad esempio, droga, stress, ecc.) possono essere persi o le fluttuazioni della linea di base possono essere interpretate erroneamente. È anche importante assicurarsi che la nuova gabbia induca uno stress da novità con conseguente ipofagia. Sebbene diversi protocolli suggeriscano che l'uso di una nuova gabbia è sufficiente da solo, abbiamo osservato che le gabbie non utilizzate prima ma contenenti lettiere e arricchimento possono non indurre stress, poiché i ratti sono spesso utilizzati per la pulizia/modifica settimanale delle gabbie. Pertanto, dovrebbe essere utilizzata una nuova gabbia vuota. Poiché l'assunzione di alimenti pre-test può anche influire sui risultati, l'assunzione di cibo deve essere monitorata prima della prova. Questo può essere fatto facilmente in modo automatizzato.

In letteratura, vari test alternativi sono usati per valutare diversi aspetti del comportamento depressionale (spesso disperazione al posto dell'anedonia); tuttavia, i metodi illustrati all'interno di questo manoscritto hanno diversi vantaggi. Un metodo alternativo comunemente usato per valutare la disperazione comportamentale come parte del comportamento simile alla depressione è il test di nuoto forzato4. Con la presente non viene valutato alcun consumo alimentare; pertanto, non vi è alcun rischio di misurare l'imprecisione.

Questo protocollo presenta molti altri svantaggi. Una recente recensione ha concluso che il test di nuoto forzato è un test che in realtà misura le strategie di stress coping e non il comportamento simile alladepressione 17. Inoltre, se si preferisce un design crossover per ridurre il numero di animali secondo le "tre R" del benessere animale, il test di nuoto forzato non può essere applicato, poiché può esercitare un effetto duraturo (traumatizzante) sul comportamento degli animali testati18.

Al contrario, l'SPT e il NIH non hanno entrambi aspetti traumatizzante e possono essere ripetuti. Inoltre, da notare, la fase di allenamento prima che il SPT e il NIH stabiliscano un'assuezione al consumo; pertanto, ripetere il protocollo è possibile. Dopo il test, il cibo appetibile (soluzione di saccarosio o spuntino) viene rimosso e l'allenamento viene reintrodotto circa 24 ore dopo il test; quindi, i roditori hanno una pausa senza accesso allo stimolo appetibile. Si presume che dopo la pausa, dovrebbe verificarsi un nuovo periodo di allenamento con adattamento per garantire un rapporto di preferenza di circa 1 o che si ottiene un apporto stabile di snack di base prima di ripetere le prove.

Un test simile al test di nuoto forzato è il test di sospensione della coda, un periodo di stress a breve termine e ineludibile in cui gli animali sono sospesi dalla coda e sviluppano una postura immobile interpretata come un segno di comportamento simile alla depressione19. Questo test può essere utilizzato solo nei topi, poiché i ratti non devono essere sospesi dalla coda a causa di un peso mediopiù elevato 20, mentre il TSS e il NIH possono essere utilizzati sia nei topi che nei ratti.

Ulteriori vantaggi dei test presentati in questo manoscritto sono che il test di ipofagia indotta dalla novità mostra una buona validità del costrutto; pertanto, misura bene i suoi crediti21,,22. Di conseguenza, la quantità della sostanza appetibile consumata è correlata all'intensità dell'anedonia, corroborata dalla conformità dei risultati SPT e NIH con altri test comportamentali12. Inoltre, sia il test di preferenza del saccarosio che il test di ipofagia indotto dalla novità hanno una buona validità facciale. Sono soggettivamente visti come la misurazione di ciò che si intende (qui, anedonia valutata come ridotta assunzione di sostanze appetibili)21,22.

Le principali limitazioni del sistema automatizzato di monitoraggio delle assunzioni sono i requisiti per una corretta formazione e manutenzione / pulizia quotidiana del sistema, il che lo rende ad alta intensità di manodopera rispetto ai protocolli manuali. Negli esperimenti precedenti10, è stato osservato che sebbene i giovani ratti si adattino al sistema automatizzato, i ratti più anziani a volte non lo fanno. Questi animali dovrebbero ovviamente essere esclusi dall'esperimento.

Per quanto riguarda le limitazioni del test comportamentale, va detto che l'allenamento richiede anche molto tempo, in particolare il NIH. Inoltre, i protocolli sono sia a breve termine, e l'applicazione a lungo termine può portare a malnutrizione. Finora, la letteratura non segnala l'uso di questi test in stati di fame (ad esempio, un modello per l'anoressia nervosa, un disturbo alimentare comunemente associato ai sintomi della depressione), quindi non c'è alcuna raccomandazione sul loro uso per gli stati di fame.

Con questo protocollo, è possibile rilevare solo se c'è anedonia (assunzione ridotta di liquido / spuntino). Tuttavia, non è in grado di quantificare specificamente il grado di anedonia. In futuro, l'introduzione di diverse bottiglie con diverse concentrazioni di saccarosio potrebbe essere una possibile aggiunta per quantificare ulteriormente l'anedonia. Nel complesso, l'uso del monitoraggio automatico dell'assunzione può essere utile in qualsiasi esperimento in cui sia necessaria un'accurata rilevazione dell'assunzione, ad esempio monitorando l'assunzione orale di farmaci sciolti nell'acqua potabile per studi farmaceutici.

In sintesi, il test delle preferenze sul saccarosio e il test dell'ipofagia indotta dalla novità sono protocolli ben consolidati per valutare l'anedonia come parte del comportamento simile alla depressione nei roditori. Se combinato con il sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo, anche sottili differenze possono essere rilevate in modo affidabile e ripetibile.

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Disclosures

A.S. è consulente per a & r Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda e Schwabe. Non esistono conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento della Fondazione tedesca per la ricerca (STE 1765/3-2) e del Charité University Funding (UFF 89/441-176, A.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Assembly LH Cage Mount - RAT-FOOD - includes Stainless cage mount, hopper, blocker, coupling Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BCMPRF01
Assembly LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD includes stainless steel cage mount, hopper, blocker, unplugged adapter, coupling Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BCMUPRF01
cage w/ 2 openings - RAT - costum modified cage - includes cage top and standard water bottle Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BCR02 single housing
Data collection Laptop Windows - Configured w/ BioDAQ Software Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BLT003
enrichment (plastic tubes, gnawing wood) distributed by the animal facility
HoneyMaid Graham Cracker Crumbs Nabisco, East Hanover, NJ, USA ASIN: B01COWTA98 palatable snack for NIH test
low vibration polymer rack Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BRACKR
male Sprague Dawley rats Envigo Order Code: 002
Model #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - includes cables, and calibration kit Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BCC32_03
Peripheral sensor Controller - includes cable Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BPSC01
SigmaStat 3.1 Systat Software, San Jose, CA, USA statistical analysis
Stainless steel blocker Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA BBLKR
standard rodent diet with 10 kcal% fat Research Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USA D12450B
sucrose powder Roth 4621.1 for SPT

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References

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Medicina Numero 159 test di anedonia modello animale comportamento depressione sistema automatizzato di assunzione di alimenti e liquidi ratti
Preferenza per il saccarosio e test di ipofagia indotti dalla novità nei ratti utilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio dell'assunzione di cibo
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Schalla, M. A., Kühne, S. G.,… More

Schalla, M. A., Kühne, S. G., Friedrich, T., Hanel, V., Kobelt, P., Goebel-Stengel, M., Rose, M., Stengel, A. Sucrose Preference and Novelty-Induced Hypophagia Tests in Rats using an Automated Food Intake Monitoring System. J. Vis. Exp. (159), e60953, doi:10.3791/60953 (2020).

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