हम भ्रूणस्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न भ्रूणीय निकायों में उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के बाद मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर के आवेदन की रिपोर्ट करते हैं। यह तकनीक भ्रूणस्टेम कोशिका भेदभाव के दौरान किसी दिए गए जीन के ख्यात संवर्न्दरों और प्रमोटर क्षेत्रों के बीच संपर्कों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है।
स्तनधारी विकास के दौरान, कोशिका फैट्स नियामक नेटवर्क की स्थापना के माध्यम से निर्धारित किए जाते हैं जो जीन अभिव्यक्ति की विशिष्टता, समय और स्थानिक पैटर्न को परिभाषित करते हैं। प्लुरीपोटस्टेम सेल से प्राप्त भ्रूणीय निकाय (ईबी) मुख्य तीन रोगाणु परतों के भेदभाव का अध्ययन करने और सेल भाग्य विनिर्देश के दौरान नियामक सर्किट को परिभाषित करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल रहे हैं। हालांकि यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि ऊतक विशिष्ट बढ़ाने प्रमोटरों के साथ बातचीत करके इन नेटवर्कों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, उन्हें अपने प्रासंगिक लक्ष्य जीन को निर्दिष्ट अभी भी चुनौतीपूर्ण बना हुआ है । इसे संभव बनाने के लिए, विकास के दौरान बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों और उनकी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यहां, हमने ईबी विभेदन मॉडल में कॉग्नेट प्रमोटरों के साथ बढ़ाने वालों और उनके संपर्कों को परिभाषित करने के लिए 4C विधि को अनुकूलित किया। विधि अक्सर प्रतिबंध एंजाइमों, ध्वनि, और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर प्रोटोकॉल वाणिज्यिक डीएनए पुस्तकालय तैयार करने किट के साथ संगत का उपयोग करता है । बाद में, 4C पुस्तकालयों को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के अधीन किया जाता है और बायोइंफॉर्मेटिक रूप से विश्लेषण किया जाता है, जिससे उन सभी दृश्यों का पता लगाने और मात्रा निर्धारित की जाती है जिनके पास चुने हुए प्रमोटर के साथ संपर्क होते हैं। परिणामस्वरूप अनुक्रमण डेटा का उपयोग भेदभाव के दौरान बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों की गतिशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। ईबी भेदभाव मॉडल के लिए वर्णित तकनीक को लागू करना आसान है।
चूहों में, ३.५ दिन पुराने भ्रूण के आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में भ्रूणीय pluripotent स्टेम कोशिकाएं होती हैं । आईसीएम आगे दिन 4.5 पर एपिब्लास्ट में विकसित होता है, जिससे एक्टोडर्म, मेसोडरम और एंडोडर्म कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं, जो भ्रूण में मुख्य तीन रोगाणु परतें होती हैं। यद्यपि आईसीएम में प्लूरिटेंट कोशिकाएं केवल वीवो में क्षणिक रूप से मौजूद हैं, लेकिन उन्हें माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एमसीएससी)1,2,2,3की स्थापना द्वारा संस्कृति में पकड़ा जा सकता है। एमसीईसी एक अविभेदित स्थिति में रहते हैं और अनिश्चित काल तक पैदा होते हैं, फिर भी आंतरिक और बाह्य उत्तेजनाओं पर वे भी pluripotenc राज्य से बाहर निकलने और तीन विकासात्मक रोगाणु परतों2,,4की कोशिकाओं को पैदा करने में सक्षम हैं । दिलचस्प बात यह है कि जब छोटी बूंदों में निलंबन में सुसंस्कृत, एमसीईसी तीन आयामी समुचेगित (यानी, ईबीएस) बनाते हैं जो सभी तीन रोगाणु परतों5में अंतर करते हैं। ईबी गठन परख प्रारंभिक वंश विशिष्टता प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
वंश विशिष्टता के दौरान, प्रत्येक रोगाणु परत की कोशिकाएं एक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम4प्राप्त करती हैं। जीन की सटीक स्थानिक अभिव्यक्ति को विविध सीआईएस-नियामक तत्वों द्वारा विनियमित किया जाता है, जिसमें कोर प्रमोटर, एन्हांसर, साइलेंसर और इंसुलेटर6,,7,,8,,9शामिल हैं। बढ़ाने, नियामक डीएनए खंड आम तौर पर कुछ सौ आधार जोड़े फैले, ऊतक विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति8समंवय । स्थानीय क्रोमेटिन संरचना8,10को विनियमित करने वाले प्रतिलेखन कारकों और कोकारकों को बाध्यकारी बनाकर एन्हांसर्स सक्रिय या खामोश कर दिए जाते हैं । आमतौर पर ख्यात बढ़ाने वालों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकें जीनोम-वाइड क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन हैं जिसके बाद अनुक्रमण (सीआईपी-सीक्यू) और अनुक्रमण (ATAC-seq) तकनीकों का उपयोग करके ट्रांसपोसे-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख। इस प्रकार, सक्रिय एन्हांसर्स विशिष्ट सक्रिय हिस्टोन के निशान और स्थानीय डीएनए पहुंच11,,12,13,,14में वृद्धि से विशेषता है।, इसके अलावा, विकासात्मक बढ़ाने वालों को उनके कॉग्नेट प्रमोटर8,9के साथ शारीरिक बातचीत की आवश्यकता होती है। दरअसल, यह दिखाया गया है कि बढ़ाने वाले वेरिएंट और विलोपन जो बढ़ाने वाले प्रमोटर संपर्कों को बाधित करते हैं, विकासात्मक विकृतियोंको 15का कारण बन सकते हैं। इसलिए, उपन्यास तकनीकों की आवश्यकता है जो विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले कार्यात्मक एन्हांसर्स की पहचान के लिए अतिरिक्त जानकारी प्रदान करती हैं।
गुणसूत्र संरचना कैप्चर (3 सी) तकनीक16के विकास के बाद से, गुणसूत्र संपर्कों की मैपिंग का नियामक तत्वों के बीच भौतिक दूरी का आकलन करने के लिए गहन ताकीद किया गया है। महत्वपूर्ण बात, 3 सी तकनीकों के उच्च थ्रूपुट वेरिएंट हाल ही में विकसित किए गए हैं, जो गुणन, पाचन, लिगेशन और क्रोमेटिन टुकड़ों17के बीच संपर्कों की वसूली के लिए विभिन्न रणनीतियां प्रदान करते हैं। उनमें से, सीटू हाय-सी में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है जो 3 सी लिगेशन उत्पादों जीनोम-वाइड18के अनुक्रमण की अनुमति देता है। हालांकि, बढ़ाने-प्रमोटर संपर्कों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त संकल्प तक पहुंचने के लिए आवश्यक उच्च अनुक्रमण लागत विशिष्ट लोकी के अध्ययन के लिए इस तकनीक को अव्यावहारिक बनाती है। इसलिए, उच्च,संकल्प19, 20,,21,22पर लक्षित लोकी का विश्लेषण करने के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित किए गए थे ।20 इन तरीकों में से एक, अर्थात् 4C, जिसे सभी रणनीति बनाम एक के रूप में जाना जाता है, उन सभी दृश्यों का पता लगाने की अनुमति देता है जो दृष्टिकोण के रूप में चुनी गई साइट से संपर्क करते हैं। हालांकि, मानक 4C तकनीक का नुकसान प्रतिकूल पीसीआर आवश्यक है, जो अलग आकार के टुकड़ों को बढ़ाता है, छोटे उत्पादों के पक्ष में और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के बाद पूर्वाग्रह मात्रा। हाल ही में, यूमी-4सी, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं (यूमी) का उपयोग करके 4C तकनीक का एक नया संस्करण मात्रात्मक और लक्षित गुणसूत्र संपर्क प्रोफाइलिंग के लिए विकसित किया गया है जो इस समस्याको 23को दरकिनार करता है । यह दृष्टिकोण लगातार कटर, सोनिकेशन और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करता है, जिससे अपेक्षाकृत समान लंबाई वितरण के साथ डीएनए टुकड़ों का प्रवर्धन शामिल है। यह एकरूपता छोटे दृश्यों के लिए पीसीआर वरीयताओं की प्रवर्धन प्रक्रिया में पूर्वाग्रहों को कम करती है और स्थानिक रूप से जुड़े अणुओं/टुकड़ों की कुशल वसूली और सटीक गिनती की अनुमति देती है ।
यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो ईबी विभेदन के दौरान प्रमोटरों और वंश शिक्षाप्रद प्रतिलेखन कारकों के बढ़ाने के बीच क्रोमेटिन संपर्कों की पहचान करने और निर्धारित करने के लिए यूमी-4सी तकनीक को अनुकूलित करता है।
हैंगिंग ड्रॉप कल्चर विधि को अतिरिक्त विकास कारकों या साइटोकिनों की आवश्यकता नहीं होती है और एमसीईसी5की पूर्व निर्धारित संख्या से ईबी की सजातीय आबादी को पुन: उत्पन्न करता है । यहां हम ईबी विभेदन मॉडल में वंश विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों के बढ़ाने-प्रमोटर संपर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए UMI-4C दृष्टिकोण से अनुकूलित मात्रात्मक 4C के प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । हमने क्रोमेटिन क्षेत्रों की पहचान की जो ईबी भेदभाव के दौरान गतिशील अंदाज में Pou5f1 और टी जीन के प्रमोटरों से संपर्क करते हैं। Pou5f1 ईबी भेदभाव के दौरान डाउनरेकेटेड था और Pou5f1 प्रमोटर और उसके डिस्टल एन्हांसियर के बीच संपर्क आवृत्ति में कमी आई। इसके विपरीत, ईबी भेदभाव के दौरान टी को अपरेच किया गया था और हमने तीन एन्हांसर्स की पहचान की जिसके लिए उनके प्रमोटर के साथ संपर्क आवृत्तियों में कमी आई है(चित्रा 3)। पहचान की पुष्टि करने के लिए, सक्रिय हिस्टोन मार्क एच3के27एसी की क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन (सीआईपी) परख24किया जा सकता है, क्योंकि इस हिस्टोन मार्क को बढ़ाने वाले सक्रियण से जुड़ा हुआ दिखाया गया है और संयोजिका अपने निष्क्रियता11के दौरान इस निशान को खो देते हैं।
विशिष्ट जीनोमिक साइटों25के क्रोमेटिन संपर्क प्रोफ़ाइल का सर्वेक्षण करने के लिए एक मानक 4सी तकनीक का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है । हालांकि, पीसीआर खंड आकार की विषमता और पीसीआर डुप्लिकेट को अलग करने की असंभवता के कारण26,,27,,28 को व्यापक सामान्यीकरण के बाद भी इस दृष्टिकोण की मात्रात्मक व्याख्या करना मुश्किल है। हमारी मात्रात्मक 4सी विधि काफी हद तक यूएमआई-4सी तकनीक के समान है जो क्लासिक 4सी दृष्टिकोण23की सीमा को बाईपास करने के लिए सोनिकेशन और एक नेस्टेड-लिगेशन-मध्यस्थता पीसीआर चरण का उपयोग करके एकल अणुओं के परिमाणीकरण की अनुमति देती है। हालांकि, यूमी-4सी के विपरीत जो अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं का उपयोग करता है, हमारा मात्रात्मक 4C प्रोटोकॉल सोनिकेशन चरण द्वारा उत्पादित विशिष्ट डीएनए ब्रेक के आधार पर एकल अणुओं के परिमाणीकरण की अनुमति देता है। यह हमारे प्रोटोकॉल वाणिज्यिक डीएनए पुस्तकालय तैयारकरने किट के साथ संगत बनाता है, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं के साथ प्राइमर की जरूरत का निराकरण ।
हमारे प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। शास्त्रीय 4C विधि28में, हमारे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कारक 3 सी अणुओं की तैयारी के दौरान पाचन और लिगेशन की दक्षता हैं। कम पाचन/लिगेशन क्षमता नाटकीय रूप से ब्याज के एक टुकड़े के साथ बातचीत की जटिलता को कम कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक कम संकल्प । जैसा कि पहले23वर्णित है, प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए प्राइमर का डिजाइन है। दूसरी पीसीआर रिएक्शन प्राइमर को पूछताछ प्रतिबंध स्थल से 5-15 एनटी स्थित होना चाहिए। एक 75 nt अनुक्रमण पढ़ने में, यह मानचित्रण के लिए कब्जा लंबाई के कम से कम 40 nt छोड़ दिया के लिए अनुमति देता है। पहली पीसीआर प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर को दूसरे प्राइमर के ऊपर डिजाइन किया जाना चाहिए जिसमें कोई ओवरलैप नहीं होना चाहिए और दोनों को कुशल डीएनए प्रवर्धन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त विशिष्ट होना चाहिए। मल्टीप्लेक्सिंग के लिए, प्राइमर को स्वतंत्र रूप से डिजाइन किया जाना चाहिए, जिसका लक्ष्य पिघलने वाले तापमान (टीएम)60-65 डिग्री सेल्सियस के लिए है। इसके अलावा, अन्य 3 C तकनीकों के लिए, मात्रात्मक 4C विधि का संकल्प प्रोटोकॉल25में उपयोग किए जाने वाले प्रतिबंध एंजाइम द्वारा निर्धारित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल 4 बीपी रिकग्निशन साइट, एमबीओआई के साथ एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करता है। इस एंजाइम के साथ अधिकतम संकल्प लगभग 500 बीपी है, लेकिन यह अत्यधिक लोकस निर्भर है और शायद ही कभी हासिल किया जाता है। एक और सीमा यह है कि एक ही प्रतिबंध के टुकड़े में स्थित तत्वों के बीच होने वाली बातचीत का पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अलावा, एक प्रतिबंध स्थल की दूरी पर होने वाली बातचीत को अपाच्य पृष्ठभूमि से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है। लिगेशन से पहले एक फिल-इन चरण का उपयोग इन बातचीत का पता लगाने की अनुमति दे सकता है।
मात्रात्मक 4C आदर्श रूप से लक्षित लोकी के क्रोमेटिन संपर्कों से पूछताछ करने के लिए अनुकूल है। हालांकि, विशिष्ट पीसीआर प्रवर्धन कदम एक साथ जांच की जा सकती है कि loci की संख्या को सीमित करता है। लक्षित लोकी की संख्या बढ़ाने का एक तरीका कई लक्ष्यों को बढ़ाना करने के लिए पीसीआर कदमों को मल्टीप्लेक्स करना है, लेकिन इसके लिए कार्यान्वयन से पहले प्रत्येक प्राइमर जोड़ी का उपयोग और परीक्षण करने वाले प्राइमर की अनुकूलता की आवश्यकता होती है। यदि प्रमोटरों पर क्रोमेटिन वास्तुकला के वैश्विक परिवर्तन वांछित हैं, तो जीनोम-व्यापी दृष्टिकोण जैसे हाय-सी, पीसी हाय-सी, या हिचआईपी29,,30,,31अधिक उपयुक्त होंगे।
The authors have nothing to disclose.
हम एफ ले डिली, आर Stadhouders और उनकी सलाह और चर्चा के लिए ग्राफ प्रयोगशाला के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । जीएस को मैरी Sklodowska-क्यूरी फैलोशिप (H2020-MSCA-IF-2016, miRStem), एक जुआन डे ला Cierva पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (MINECO, FJCI-2014-22946) द्वारा टीटी द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा 7फ्रेमवर्क प्रोग्राम FP7 (ईआरसी सिनर्जी ग्रांट 4डी-जीनोम, अनुदान समझौते 609989 को टीजी), स्पेन के अर्थव्यवस्था, उद्योग और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय (एमईआईसी) को ईएमबीएल साझेदारी, सेंट्रो डी एक्सेलेंसिया सेवेरो ओचोआ 2013-2017 और सीईआरसीए प्रोग्राम जनरलिट डी कैटाल्यून्या के तहत समर्थन दिया गया था।
0.1% EmbryoMax gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | Cell culture |
0.25% Trypsin-EDTA | 25200072 | ||
AMPure XP | Beckman Coulter | 10136224 | 4C/DNA purification |
B27 supplement | Gibco | 17504044 | Cell culture |
Beta-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 | Cell culture |
Bioruptor Pico | Diagencode | B01060010 | 4C/sonication |
BSA | NEB | B9000S | 4C |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | Cell culture |
CIP | NEB | M0212 | 4C |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | 4C |
DMEM/F12 medium | Gibco | 11320033 | Cell culture |
dNTP | NEB | N0447S | 4C |
ESGRO Leukaemia Inhibitory Factor (LIF) | EMD Millipore | ESG1107 | Cell culture |
Formaldehyde solution (37%) | Sigma | 252549-25ML | 4C |
Glycin | Sigma | GE17-1323-01 | 4C |
Glycogen | ThermoFischer | R0551 | 4C |
Herculase II Fusion DNA polymerase | Agilent | 600675 | 4C |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I3021-50ML | 4C |
Knockout DMEM | 10829018 | ||
L-glutamine | Gibco | 25030081 | Cell culture |
MboI | NEB | R0147M | 4C |
MEM non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | Cell culture |
N2 supplement | Gibco | A1370701 | Cell culture |
NEBNext DNA Library prep | NEB | E6040 | 4C |
NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | 4C/digestion |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Cell culture |
PD0325901 | Selleck Chemicals | S1036 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Proteinase K | NEB | P8107S | 4C |
Qubit 4 Fluorometer | ThermoFischer | Q33238 | 4C |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFischer | Q32851 | 4C |
RNase A | ThermoFischer | EN0531 | 4C |
Sodium pyruvate solution | Gibco | 11360070 | Cell culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | Cell culture |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | 4C |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | M0202M | 4C |