살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비
Summary
이 프로토콜의 목표는 Drosophila meiotocytes를 사용하여 살아있는 고정 세포 현미경 검사법에 의해 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 분석하는 것입니다. 이 프로토콜은 Drosophila 유충과 초기 번데기에서 전체, 손상되지 않은 고환을 분리하는 방법과 현미경 검사를 위해 처리하고 장착하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
세포 분열이 발달, 조직 항상성 및 질병 과정과 어떻게 통합되는지에 대한 우리의 이해에 필수적입니다. (1) 정자를 포함하는 전체 Drosophila 고환은 현미경 검사법을 위해 준비하기 가 상대적으로 쉽기 때문에, (2) 정자 세포의 큰 크기는 고해상도 화상 진찰을 위해 그(것)들을 잘 적색하고, (3) 강력한 Drosophila 유전 공구는 생체 내 분석과 통합될 수 있기 때문에 만연증을 겪고 있는 혈소판 세포는 이 분석을 위해 이상적입니다. 여기에서, 우리는 Drosophila 제 3 instar 애벌레 및 초기 pupae에서 전체 고환의 준비를 위한 쉽게 접근가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 준비된 전체 고환에 있는 meiotic 정자 를 확인하는 방법과 시간 경과 현미경 검사법에 의해 그(것)들을 사는 심상하는 방법을 기술합니다. 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜도 제공됩니다. 애벌레 고환의 사용은 정자 세포 분석을 위해 성인 고환을 사용하는 사용 가능한 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 가장 중요한 것은, 애벌레 고환은 성인 고환 보다는 세포로 더 작고 적게 혼잡하고, 이것은 크게 정액 세포의 고해상도 화상 진찰을 촉진합니다. 이러한 장점과 프로토콜의 적용을 입증하기 위해, 우리는 시간 경과 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 단일 정자 세포에서 세포 분열 동안 스핀들 미세소관에 대하여 소포체의 재분배를 보여주는 결과를 제시한다. 프로토콜은 형광 태그 단백질 또는 세포 기관 마커의 수의 발현과 결합 될 수있다, 유전자 돌연변이 및 기타 유전 도구뿐만 아니라, 전체 조직과 장기의 생리적 맥락에서 세포 분열 메커니즘의 분석을 위해이 접근 방식을 특히 강력.
Introduction
세포 분열은 배양1에서자란 세포주를 사용하여 종종 연구된다. 우리는 이 연구 결과2에서근본적인 기계장치의 귀중한 통찰력 그리고 이해의 재산을 얻고 있는 동안, 배양에서 성장한 세포는 온전하고 살아있는 조직에서 생기는 세포 분열의 생리학을 완전히 되풀이할 수 없습니다. 예를 들어, 손상되지 않은 조직 및 장기에서 세포는 자손 세포가 조직 내에 적절하게 위치할 수 있도록 적절한 장소와 적절한 시기에 분할하여 적절한 분화 또는 기능적 프로그램을 겪을 수 있도록 하고 세포 증식이 조직 성장 또는 항상성과 적절하게 조정되도록 해야 합니다3. 한편, 배양에서 성장한 세포의 경우, 세포 분열은 일반적으로 배양 배지4의성장 인자에 의해 조절되며, 따라서 우리는 이러한 세포로부터 조직 구조 또는 발달 신호전달과 같은 환경적 요인이 분열 과정에 어떻게 영향을 미치는지 배울 수 없다. HeLa 및 U2OS 세포와 같은 세포 분열을 연구하는 데 사용되는 많은 세포주가 전이성 종양5에서유래되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 암세포의 기본 생리학의 많은 양상, 예: 세포 주기 조절 기전 및 염색체 안정성은 건강한 세포에 비해 변경되었을 가능성이 있다. 세포 분열 생리학의 완전한 이해는, 그러므로, 생리적인 규정 기계장치 및 조직 건축을 보존하는 그들의 네이티브, 생체 내 환경에서 분할 세포를 공부하는 우리의 기능에 달려 있습니다.
세포 분열이 손상되지 않은 조직 및 기관 내에서 어떻게 작동하는지 이해하는 발전은 생체 내 또는 생체 내 분석에 내재된 어려움에 의해 방해받습니다. 첫째, 큰 기관 또는 두꺼운 조직 내의 현미경 분석을 위해 분할 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있습니다. 둘째, 개별 세포가 생체 내에서 분할 될 때 예측하는 것은 종종 어렵습니다. 셋째, 조직 생리학은 생체 배양 동안 급속히 악화될 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 완전히 온전한 고환 내의 meiotic 세포 분열을 겪을 때 Drosophila melanogaster 정액 세포의 살아있는 및 고정된 분석을 위한 쉽게 접근가능한 방법을 기술합니다. 이 세포는 공초점 현미경 검사법과 같은 표준 광학 방법으로 쉽게 접근할 수 있기 때문에 생체 내 생체 분석에 이상적이며, 예측 가능한 시간과 위치에서 분할되며, 손상되지 않은 고환은 최대 약 24 시간 동안 생체 배양에서 유지될 수 있습니다. 또한, Drosophila 정자 세포는 큰 둥근 세포 (약 20-30 μm 직경) 그들은 분할 할 때 모양을 변경하지 않습니다, 스핀들 장치 및 세포질 세포기관과 같은 세포 구성 요소의 고해상도, 시간 경과 이미징에 이상적이다. 이 세포는 유사분열과 반대로 만피증을 겪더라도, 많은 필수 세포 분열 프로세스는 이 2개의 세포 분열 기계장치6사이에서 아주 유사합니다. 이러한 장점은, 강력한 Drosophila 유전 도구와 결합, 스피들 형성 및 조절, 사이토 카인시스, 및 소기관 리모델링 및 분할7,8,8,9,,10,,11을포함하여 필수 세포 분열 과정의 생체 분석을 위해 광범위하게 사용되는 모델로 Drosophila 정자 세포를 만들었습니다.
정자 세포는 정자 발생의 meiotic 단계에 있는 세포입니다. Drosophila에서정자 발생은 고환12,,13의한 극에서 작은 영역 또는 “허브”에 위치한 생식선 줄기 세포의 그룹으로 시작됩니다. 이 세포는 비대칭 유사분열에 의해 분할되고, 단 하나 분화한 정자를 초래합니다. Spermatogonia는 그 때 단 하나 낭종 내의 밀접하게 연관된 남아 있는 16의 세포의 단을 생성하기 위하여 4개의 동기 미토를 겪습니다. 이 단계에서, 세포는 meiotic 세포 주기에 유사분열에서 전이하고 정액 세포로 불립니다. 정자 세포는 세포 주기의 확장된 G2 단계에서 약 2~3일을 소비하며, 이 기간 동안 극적으로 성장하고 두 가지 메소다 분열 및 후속 정자 발생에 대비하여 세포학적 변화를 겪는다13,,14. 단일 낭종 내의 16 정자 세포의 전체 그룹은 동시에 첫 번째 meiotic 분열을 입력합니다. 따라서, 몇몇 meiotic 정자 는 세포 분열을 통해서 진행하는 때 동시에 심상될 수 있습니다. 첫번째 meiotic 분할은 대략 1.5 시간 동안 진행하고 성숙한 정자로 분화하기 위하여 계속하는 64의 총 정자를 산출하는 두 번째 meiotic 분할에 의해 거의 즉시 따릅니다.
살아있는 세포 분열을 연구하기 위하여 정액 세포를 사용하는 유일한 이점은, 온전한 조직은 세포의 단 또는 낭종이 정액 발생의 다른 단계를 통해 지속적으로 점진하고, 정액 발생의 모든 단계에서 세포는 일반적으로 어떤 주어진 된 고환에서 확인될 수 있습니다 (그림 3A참조). 따라서 전체 고환에서 meiotic 세포를 찾는 것이 비교적 쉽습니다. 우리는 일반적으로 이 세포가 고해상도 화상 진찰에 훨씬 더 크고 더 순종하기 때문에 두 번째 만두와 반대로 첫번째에 우리의 분석을 집중합니다, 그러나 두 meiotic 분할을 포괄하는 전체 프로세스는 성공적으로 심상될 수 있습니다. 또한 고환 제제 및 배양을 위한 일반적인 프로토콜은 정자 의전증으로 성숙함에 따라 발생하는 초기 유사분열 줄기 세포 또는 정자 분열 또는 세포학적 변화와 같은 정자 발생의 다른 과정을 분석하는데 사용될 수 있다는 점에 유의해야 한다15. 정자 발생의 이러한 측면의 대부분은 매우 초파리와 인간 사이에 보존16.
초파리 정자세포는 초파리 발달13의세 번째 유충 단계에서 정자 발생의 메소형성 단계에 도달하기 시작한다. 따라서, 세 번째 instar 애벌레로 시작하고 pupae 및 성인을 포함하여 수명 주기 단계에서 격리된 고환은 정자 세포의 분할 분석용으로 사용될 수 있습니다. 몇 가지 우수한 프로토콜은 정자 발생의 라이브 및 고정 분석을위한 성인 남성 파리에서 고환의 추출을 위해 사용할 수 있습니다17,,18,,19. 이 프로토콜은 정자 발생의 후기 단계를 공부하기 위해 바람직할 지도 모릅니다 또는 성인에서만 보이는 유전 마커가 이용되어야 하는 경우에. 이 프로토콜은 이 단계에서 고환이 고해상도, 시간 경과 현미경 검사법에 의하여 세포 분열 분석에 특히 관련되는 몇몇 이점이 있기 때문에, 애벌레와 초기 pupae에서 고환 준비에 대신 집중합니다. 첫째, 애벌레와 번데기의 고환은 성인보다 작고 장기 내의 세포는 덜 혼잡합니다. 이 때문에, 분할 정자 세포는 종종 빛 산란 조직의 여러 층을 통해 침투 할 필요없이, 애벌레 고환의 외부 표면 근처에 이미지 화 될 수있다. 둘째, 성인 고환은 연결된 부속 기관의 수축으로 인해 리드미컬하게 움직이며, 이러한 움직임은 개별 세포의 시간 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 셋째, 애벌레 고환은 pupal 또는 성인 치사성을 일으키는 유전자 돌연변이를 연구할 때 유리합니다. 우리의 방법은 현미경 단계에 고환의 장기 문화를 위해 최적화되어, 동일한 준비에 있는 정액 발생의 다중 단계를 통해 세포 분열의 다중 라운드 또는 개별 세포의 진행의 화상 진찰을 허용합니다. 우리는 또한 전체 고환의 고정 및 면역 염색을 위한 프로토콜을 기술합니다. 전반적으로, 우리의 프로토콜은 손상되지 않은 조직에서 세포 분열을 공부에 관심이 있는 사람들을 위해 특히 유용하고, 고도로 견인성 Drosophila 유전 공구와 정액 세포 분석을 결합하는 기능은 이것을 특히 강력한 접근하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 정액 세포 분열의 장기, 살아있는 화상 진찰을 위해 최적화된 애벌레 또는 초기 pupal Drosophila 고환의 준비를 위한 프로토콜을 기술했습니다. 이것은 손상되지 않은 조직의 생리적 맥락에서 세포 분열을 분석하기위한 강력한 방법입니다. 이 방법의 힘은 특정 유전자 돌연변이, 조직 특이적 RNAi 매개 억제 및 형광 표지된 단백질 및 세포기관 마커와 같은 Drosophila 유전 도구와 결?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 J.T.S에 국방부 창업 자금에 의해 지원되었다.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
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