אולטרסאונד בתדירות גבוהה אקו קרדיוגרפיה כדי להעריך Zebrafish תפקוד הלב
Summary
אנו מתארים פרוטוקול להערכת מורפולוגיה לב ותפקוד של בוגרים בדגים באמצעות אקו בתדר גבוה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה של הלב והקוונפיקציה הבאים של פרמטרים פונקציונליים, כגון קצב הלב (HR), פלט לב (CO), שינוי באזור החלקי (FAC), הוצאה לפליטה (EF), וזרימה ומהירויות זרימה.
Abstract
הדגים (danio rerio) הפך לאורגניזם מודל פופולרי מאוד במחקר לב וכלי דם, כולל מחלות לב האדם, בעיקר בשל השקיפות העובריות שלה, מעקב גנטי, ו הנועם כדי מהיר, תפוקה גבוהה לימודים. עם זאת, הפסד של שקיפות מגביל ניתוח תפקודי לב בשלב המבוגר, אשר מסבך את הדוגמנות של מצבי לב הקשורים לגיל. כדי להתגבר על מגבלות כאלה, אולטרסאונד בתדר גבוה האקו בדגים הוא מתגלה כאופציה מעשית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי להעריך את תפקוד הלב ב דג זברה מבוגרים על ידי האקו לא פולשנית באמצעות אולטרסאונד בתדר גבוה. השיטה מאפשרת הדמיה וניתוח של מימד לב הדגים וככמת של פרמטרים פונקציונליים חשובים, כולל קצב הלב, עוצמת שבץ, פלט לב, ושבריר פליטה. בשיטה זו, הדג מורדם ונשמר מתחת למים וניתן לשחזר לאחר ההליך. למרות שאולטרסאונד בתדר גבוה היא טכנולוגיה יקרה, אותה פלטפורמת הדמיה ניתן להשתמש עבור מינים שונים (למשל, מורצין ו zebrafish) על ידי התאמת התמרה שונים. האקו הוא שיטה איתנה עבור פנוטיפים לב, שימושי באימות ואפיון של דגמי מחלות, בעיקר מחלות מאוחרות; מסכי התרופות; ומחקרים של פציעת לב, החלמה ויכולת התחדשות.
Introduction
הדגים (danio rerio) הוא מודל בעלי חוליות מבוסס היטב למחקרים של תהליכים התפתחותיים ומחלות אדם1. Zebrafish יש דמיון גנטי גבוה לבני אדם (70%), היכולת הגנטית, פוריות גבוהה, ושקיפות אופטית במהלך פיתוח עובריים, אשר מאפשר ניתוח חזותי ישיר של איברים ורקמות, כולל הלב. למרות שיש רק אטריום אחד וחדר השינה אחד, לב דג זברה (איור 1) הוא דומה באופן מבחינה פיזיולוגית לבבות ארבעה הצ. חשוב מכך, קצב פעימות הלב, מורפולוגיה חשמלית וצורה פוטנציאלית לפעולה דומים לאלה של בני האדם יותר מאשר מיניםמורניים 2. תכונות אלה הפכו דג זברה מודל מצוין עבור מחקר לב וכלי דם סיפקו תובנות מרכזיות להתפתחות הלב3,4, התחדשות5, התנאים הפתולוגית1,3,4, כולל טרשת עורקים, cardiomyopathies, הפרעות בקצב הלב, מחלות לב מולדות, ו-עמילואיד שרשרת האור קרדיולוגית1,4,6. הערכה של תפקוד לב אפשרי במהלך השלב העובריים (1-ימים הפריה פוסט) באמצעות ניתוח וידאו ישירה באמצעות מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה7,8. עם זאת, דגים מאבדים את השקיפות שלהם מעבר לשלב העובריים, הגבלת הערכות פונקציונליות של לבבות בוגרים נורמליים ומצבי לב התפרצות מאוחרת. כדי להתגבר על מגבלה זו, אקו קרדיוגרפיה מועסק בהצלחה כמו ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת חלופה הדמיה לא פולשנית כדי להעריך את פונקציית הלב הבוגרת דג זברה9,10,11,12,13,14,15.
ב-zebrafish, הלב ממוקם ventrally בחלל החזה מיד אחורי הזימים עם האטריום ממוקם על החדר. האטריום אוספת דם ורידי מתוך venosus הסינוס ומעבירה אותו אל החדר שבו הוא נשאב עוד יותר בולבוס הריוסוס (איור 1). כאן, אנו מתארים פיסיולוגי, מתחת למים, פרוטוקול להערכת תפקוד לב בוגרים דג זברה על-ידי אקו שאינו פולשני באמצעות מערך ליניארי בדיקה אולטרסאונד עם תדר מרכז של 50 MHz עבור הדמיה במצב B ברזולוציה של 30 μm. מאז גלי אולטרסאונד יכול בקלות לנסוע דרך המים, שמירה על קירבה בין הדג ואת בדיקה סריקה מתחת למים מספק מספיק משטח מגע לאיתור לב ללא צורך ג’ל אולטרסאונד והוא הכולל פחות מלחיץ את הדג. למרות שמערכות האקו-לב החלופיות דווחו על-ידי מספר סופרים9,12,13, כאן אנו מציגים את ההתקנה הכללית והנפוצה ביותר החלה על אולטרסאונד בתדר גבוה בבעלי חיים.
השיטה מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של לב דג זברה מבוגרים, מעקב אחר מבנים לב, ו כימות של מהירויות שיא מדידות זרימת דם דופלר. אנו מראים אמין בvivo פיקציה של הפרמטרים הסיסטולי החשוב הדיאסטולי, כגון שבריר הפליטה (EF), שינוי באזור החלקי (FAC), תזרים הזרימה החדרית ומהירויות זרימה, קצב הלב (HR), ופלט לב (CO). אנו תורמים להקמת מגוון אמין של רגיל מבוגר בריא הפרמטרים של לב פונקציונלי ומימדי לאפשר הערכה מדויקת יותר של מדינות הפתולוגית. בסך הכל, אנו מספקים שיטה איתנה כדי להעריך את תפקוד הלב ב-דג זברה, אשר הוכיחה שימושי מאוד בהקמת ואימות דג זברה מחלת לב מודלים6,16, פגיעה בהלב והתאוששות10,13, ו התחדשות11,12, וניתן להשתמש בנוסף כדי להעריך תרופות פוטנציאליות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שיטה שיטתית לדימות אקו-קרדיוגרפי והערכה של תפקוד לב בדגי מבוגרים. אקוקרדיוגרפיה היא השיטה היחידה שאינה פולשנית ואיתנה ביותר עבור הדמיה למבוגרים בלבד דגים לב וניתוח פונקציונלי, והוא הופך פופולרי יותר ויותר במחקר וכלי דם בדגים דג זברה. כמות הזמן הנדרשת היא קצרה ומאפשר לימודי תפו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לתמיכתו הטכנית של פרד רוברטס ולעדכון כתב היד.
Materials
| Double sided tape | |||
| Fish net | |||
| Glass container – 100 inch high | |||
| High frequency transducer | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | Band width 29-71 MHz, Centre transmit 50 MHz, Axial resolution 30 µm |
| Plastic teaspoon | |||
| Scalpel or scissors | |||
| Small fish tanks | |||
| Sponge (kitchen sponge) | |||
| Transfer pipets (graduated 3 mL) | Samco Scientific | 212 | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100 Imaging system and imaging station | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB sofware v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
References
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
- Verkerk, A. O., Remme, C. A. Zebrafish: a novel research tool for cardiac (patho)electrophysiology and ion channel disorders. Frontiers in Physiology. 3, 255 (2012).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular research. 91 (2), 279-288 (2011).
- Poon, K. L., Brand, T. The zebrafish model system in cardiovascular research: A tiny fish with mighty prospects. Global Cardiology Science and Practise. 2013 (1), 9-28 (2013).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Mishra, S., et al. Zebrafish model of amyloid light chain cardiotoxicity: regeneration versus degeneration. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 316 (5), H1158-H1166 (2019).
- Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiologycal Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
- Mishra, S., et al. Human amyloidogenic light chain proteins result in cardiac dysfunction, cell death, and early mortality in zebrafish. American Journal of Physiology Heart Circulatory Physiology. 305 (1), H95-H103 (2013).
- Ernens, I., Lumley, A. I., Devaux, Y., Wagner, D. R. Use of Coronary Ultrasound Imaging to Evaluate Ventricular Function in Adult Zebrafish. Zebrafish. 13 (6), 477-480 (2016).
- González-Rosa, J. M., et al. Use of Echocardiography Reveals Reestablishment of Ventricular Pumping Efficiency and Partial Ventricular Wall Motion Recovery upon Ventricular Cryoinjury in the Zebrafish. PLoS One. 9 (12), (2014).
- Huang, C. C., Su, T. H., Shih, C. C. High-resolution tissue Doppler imaging of the zebrafish heart during its regeneration. Zebrafish. 12 (1), 48-57 (2015).
- Kang, B. J., et al. High-frequency dual mode pulsed wave Doppler imaging for monitoring the functional regeneration of adult zebrafish hearts. Journal of the Royal Society Interface. 12 (103), (2015).
- Lee, J., et al. Hemodynamics and ventricular function in a zebrafish model of injury and repair. Zebrafish. 11 (5), 447-454 (2014).
- Sun, L., Lien, C. L., Xu, X., Shung, K. K. In Vivo Cardiac Imaging of Adult Zebrafish Using High Frequency Ultrasound (45-75 MHz). Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (1), 31-39 (2008).
- Wang, L. W., Kesteven, S. H., Huttner, I. G., Feneley, M. P., Fatkin, D. High-Frequency Echocardiography- Transformative Clinical and Research Applications in Humans, Mice, and Zebrafish. Circulation Journal. 82 (3), 620-628 (2018).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Disease Models & Mechanisms. 10 (1), 63 (2017).
- Lee, L., et al. Functional Assessment of Cardiac Responses of Adult Zebrafish (Danio rerio) to Acute and Chronic Temperature Change Using High-Resolution Echocardiography. PLOS ONE. 11 (1), e0145163 (2016).
- Genge, C. E., et al., Nilius, B., et al. . Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 171, 99-136 (2016).
