يوضح هذا البروتوكول استخدام فحص ربط القرب للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين في الموقع في خط ج. elegans الجرثومي.
إن فهم متى وأين تحدث التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPIs) أمر بالغ الأهمية لفهم وظيفة البروتين في الخلية وكيفية تأثر العمليات الأوسع مثل التنمية. إن خط كريات الإيجان اتّصال Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي رائع لدراسة مؤشرات أسعار الصفحات المرتبطة بتنظيم الخلايا الجذعية وداء الميوس والتنمية. هناك مجموعة متنوعة من التقنيات المتطورة التي تسمح بالموسومة البروتينات ذات الأهمية للاعتراف بها من قبل الأجسام المضادة القياسية ، مما يجعل هذا النظام مفيدًا لتفاعلات تقدير الربط القربي (PLA). ونتيجة لذلك، فإن جيش التحرير الشعبي قادر على إظهار أين تحدث مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بطريقة مكانية وزمنية في الخطوط الجرثومية على نحو أكثر فعالية من النهج البديلة. يوصف هنا هو بروتوكول لتطبيق وتقدير هذه التكنولوجيا للتحقيق PPIs في خط الجراثيم C. elegans.
ويقدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات لديها تفاعلات مع الجزيئات الأخرى1، مما يؤكد على مدى أهمية PPIs لتنفيذ وظائف بيولوجية محددة في الخلية2. تعمل بعض البروتينات كمحاور تسهل تجميع المجمعات الأكبر الضرورية لبقاء الخلية1. هذه المحاور التوسط PPIs متعددة وتساعد على تنظيم البروتينات في شبكة تسهل وظائف محددة في الخلية3. كما يتأثر تكوين مجمعات البروتين بالسياق البيولوجي، مثل وجود أو عدم وجود شركاء محددين يتفاعلون4،وأحداث إشارات الخلايا، ومرحلة نمو الخلية.
C. يستخدم الإيغانك ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك التنمية. يتكون التشريح البسيط لهذا الحيوان من عدة أعضاء ، بما في ذلك الغدد التناسلية والأمعاء وبشرة شفافة ، مما يسهل تحليل تطور الدودة. الخط الجرثومي المقيم في الغدد التناسلية هو أداة عظيمة لدراسة كيفية نضج الخلايا الجذعية الجرثومية إلى gametes5 التي تتطور إلى أجنة وفي نهاية المطاف الجيل القادم من ذرية. تحتوي منطقة الطرف المنفّر من الخط الجرثومي على مجموعة من الخلايا الجذعية المجددة ذاتيًا(الشكل 1). كما الخلايا الجذعية ترك مكانة، فإنها تتقدم إلى pachytene meiotic وتتطور في نهاية المطاف إلى البويضات في مرحلة الكبار الشباب(الشكل 1). يتم تنظيم هذا البرنامج من التنمية في خط الجراثيم بإحكام من خلال آليات مختلفة، بما في ذلك شبكة تنظيمية ما بعد النسخ التي تسهلها البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs)6. وتتسم مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بأهمية هذا النشاط التنظيمي، حيث ترتبط الممارسات التجارية التقييدية بعوامل مساعدة أخرى لممارسة وظائفها.
هناك العديد من النهج التي يمكن استخدامها للتحقيق في PPIs في الدودة ، ولكن كل منها له قيود فريدة من نوعها. في الامطار المناعية على الجسم الحي (IP) يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين البروتينمن مقتطفات دودة كاملة; ومع ذلك، لا يشير هذا الأسلوب إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين في الفيروس المتنقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يصعب استرداد مجمعات البروتين العابرة وتتشكل فقط خلال مرحلة محددة من التطور أو في عدد محدود من الخلايا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. وأخيرا، تحتاج تجارب الملكية الفكرية إلى معالجة مخاوف إعادة الفرز المعقدة البروتينية بعد الانزل والاحتفاظ غير محددة من البروتينات على مصفوفة تقارب.
النهج البديلة للكشف في الموقع من PPIs هي المناعة المشتركة، نقل الطاقة صدى Förster (FRET)، ومكملات الفلورسيان ثنائي الجزيئية (BiFC). يعتمد المناعي المشترك على الكشف المتزامن عن بروتينين مهتمين بأنسجة الديدان الثابتة وقياس مدى التوطين المشترك للإشارة. استخدام المجهر فائقة الدقة، والتي توفر تفاصيل أكبر من المجهر القياسي7،ويساعد على اختبار أكثر صرامة توطين البروتين المشترك وراء حاجز حيود محدودة من 200-300 نانومتر8. ومع ذلك ، فإن المناعة المشتركة باستخدام كل من المجهر التقليدي وفائق الدقة يعمل بشكل أفضل للبروتينات ذات أنماط التعريب المحددة جيدًا. وعلى النقيض من ذلك، يصبح أقل إفادة بكثير بالنسبة للشركاء المتفاعلين الموزعين توزيعاً. قياس لتوطين مشترك للإشارات على أساس التداخل لا يوفر معلومات دقيقة حول ما إذا كانت البروتينات في معقدة مع بعضها البعض9,10.
وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي المشترك والمناعة المشتركة لمجمعات البروتين البروتينليست كمية، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات كبيرة. FRET و BiFC كلاهما تقنيات تستند إلى الفلورسنت. تعتمد FRET على وضع علامات على البروتينات ذات الأهمية مع البروتينات الفلورية (FPs) التي تتداخل الطيفية التي يتم فيها نقل الطاقة من FP واحد (المانح) إلى FP آخر (مقبول)11. وينتج عن هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة الفلورسية للFP المقبول التي يمكن اكتشافها عند الطول الموجي للانبعاثات. ويستند BiFC على إعادة تشكيل بروتين الفلورسنت في الجسم الحي. فإنه ينطوي على تقسيم GFP إلى اثنين من شظايا تكميلية، مثل الحلزون1-10 والحلزون 1112،والتي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات ذات الفائدة. إذا تفاعل هذان البروتينان، تصبح الأجزاء التكميلية من GFP قريبة بما يكفي من القرب لطيها وتجميعها، مما يعيد تشكيل فلوروفور GFP. ثم يلاحظ GFP المعاد تشكيله مباشرة على أنه فلورسين ويشير إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين.
على هذا النحو ، يعتمد كل من FRET و BiFC على العلامات الفلورية الكبيرة التي يمكن أن تعطل وظيفة البروتين الموسوم. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب FRET و BiFC تعبيرًا وفيرًا وقابلًا للبروتينات الموسومة للحصول على بيانات دقيقة. قد لا تكون FRET مناسبة للتجارب حيث يكون أحد الشريكين أكثر من الآخر ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية13. يجب أيضًا تجنب التعبير المفرط في تجارب BiFC ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تجميع غير محدد14 يؤدي إلى زيادة الخلفية. تتطلب كلتا التقنيتين تحسين ظروف التعبير والتصوير للبروتينات الموسومة ، والتي قد تطيل الوقت اللازم لإكمال التجارب.
إن فحص ربط القرب (PLA) هو نهج بديل يمكن أن يعالج قيود التقنيات المذكورة أعلاه. يستفيد جيش التحرير الشعبي من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على البروتينات ذات الأهمية (أو علاماتها). ثم يتم ربط هذه الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على تحقيقات oligonucleotide التي يمكن أن تهجين مع بعضها البعض عندما ضمن مسافة 40 نانومتر (أو أقصر)15. يتم تضخيم الحمض النووي الهجين الناتج عن ذلك من خلال تفاعل PCR ، والذي يتم اكتشافه بواسطة المسابير التي تكمل الحمض النووي. وهذا يؤدي إلى بؤر التي يتم تصورها بواسطة المجهر. يمكن لهذه التكنولوجيا الكشف عن PPIs في الموقع في الأنسجة المعقدة (أي الغدد التناسلية دودة)، والتي يتم تنظيمها كخط تجميع يحتوي على خلايا في مراحل مختلفة من التطور والتمايز. مع جيش التحرير الشعبي، يمكن تصور PPIs مباشرة في الغدد التناسلية دودة ثابتة، وهو أمر مفيد للتحقيق في ما إذا كان PPIs تحدث خلال مرحلة محددة من التنمية. يقدم جيش التحرير الشعبي دقة أكبر لمؤشرات أسعار التطبيقات مقارنة بالمقالات القائمة على التعريب المشترك ، وهو مثالي لإجراء قياسات دقيقة. إذا ما استخدمت، المجهري ة فائقة الدقة لديه القدرة على توفير تفاصيل أدق حول موقع بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى داخل الخلية. ميزة أخرى هي أن بؤر الناتجة عن ردود فعل جيش التحرير الشعبي يمكن أن تحسب من قبل سير عمل تحليل ImageJ المستندة إلى، مما يجعل هذه التقنية الكمية.
تم وصف عائلة LC8 من سلاسل الضوء الدينين لأول مرة بأنها وحدة فرعية لمجمع محركات dynein16 وافترض أنها بمثابة محول بضائع. منذ اكتشافه الأولي، تم العثور على LC8 في مجمعات البروتين متعددة بالإضافة إلى مجمع محركات الدينين17،18،19،20. المسح الضوئي لتسلسل البروتين التي تحتوي على التفاعل LC8 عزر19 يشير إلى أن LC8 قد يكون لها العديد من التفاعلات مع مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة17،18،,19،20،21،22. ونتيجة لذلك، تعتبر الآن البروتينات العائلية LC8 المحاور التي تساعد على تعزيز تجميع مجمعات البروتين اتّفا ً19،22، مثل تجميع البروتينات المفككة بشكل جوهري21.
واحد C. elegans LC8-الأسرة البروتين، dynein سلسلة الضوء-1 (DLC-1)، وأعرب على نطاق واسع عبر العديد من الأنسجة وليس المخصب في هياكل محددة تحت الخلوية23،,24. وبالتالي، فإن تحديد الصلة بيولوجيا ً في الحياة العضوية في الشركاء في DLC-1 في C. elegans يشكل تحدياً لعدد من الأسباب: 1) عدم هطول المناعة المشتركة يشير إلى مصدر الأنسجة حيث يحدث التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه 2) التعبير المحدود عن شركاء معينين أو تفاعلات عابرة قد تعيق القدرة على الكشف عن التفاعل عن طريق الترسيب المناعي المشترك؛ و 3) توزيع منتشر من DLC-1 يؤدي إلى تداخل غير محدد مع البروتينات الشريك المحتملة عن طريق المناعة المشتركة. وبناء على هذه التحديات، جيش التحرير الشعبي هو نهج مثالي لاختبار في تفاعلات الجسم الحي مع DLC-1.
وقد أفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع ويعمل كعامل مساعد للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة23 (RBPs) FBF-23 وGLD-125. يدعم عملنا نموذج DLC-1 الذي يعمل كبروتين محوري ويشير إلى أن DLC-1 يسهل شبكة التفاعل التي تمتد إلى ما بعد dynein19،22. باستخدام تقسيم السحب GST, تم التعرف على RBP DLC-1 التفاعل الجديد اسمه OMA-126. OMA-1 مهم لنمو البويضات والنضج الميوطي27 ويعمل بالتزامن مع عدد من المكبوتات والمنشطات المترجمة28. في حين يتم التعبير عن FBF-2 و GLD-1 في الخلايا الجذعية ومناطق pachytene meiotic ، على التوالي ، يتم التعبير عن OMA-1 بشكل منتشر في الخط الجرثومي من pachytene meiotic من خلال البويضات27 (الشكل 1). وهذا يشير إلى أن DLC-1 تشكل مجمعات مع RBPs في مناطق مختلفة من الغدد التناسلية. كما تبين أن التفاعل المباشر بين DLC-1 و OMA-1 الذي لوحظ في المختبر لا يتم استرداده بواسطة IP في الجسم الحي. وقد استخدم جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح كنهج بديل لمزيد من دراسة هذا التفاعل في خط الجراثيم C. elegans، وتشير النتائج إلى أنه يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للتحقيق في العديد من PPIs الأخرى في الدودة.
عند دراسة PPIs في خط الجراثيم C. elegans ، فإن الدقة الأعلى التي يقدمها جيش التحرير الشعبي مقارنة بالاستمناة المشتركة تسمح بالتصور والتقدير الكمي للمواقع التي تحدث فيها التفاعلات في الخط الجرثومي. وأفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع OMA-1 باستخدام في المختبر ضريبة السلع والخدمات السحب م?…
The authors have nothing to disclose.
تم توفير بعض سلالات النيماتودا المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis الممولمن المعاهد القومية للصحة (P40OD010440). تم إجراء الفحص المجهري Confocal في مختبر الأبحاث الأساسية في جامعة مونتانا الذي تم تشغيله بدعم من جوائز NIH P20GM103546 و S10OD021806. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة GM109053 إلى E.V. ، زمالة جمعية القلب الأمريكية 18PRE34070028 إلى X.W.، وجائزة أكاديمية مونتانا للعلوم إلى X.W. ولم يشارك الممولون في تصميم الدراسة أو كتابة التقرير. ونشكر م. إلينبيكر على المناقشة.
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |