Transport axonal des Organlles dans les cultures de neurones moteurs à l’aide du système de chambres microfluidiques
Summary
Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé des neurones moteurs. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode détaillée pour suivre le transport axonal des compartiments acides et des mitochondries dans les axones des neurones moteurs à l’aide de chambres microfluidiques.
Abstract
Les neurones moteurs (MNs) sont des cellules fortement polarisées avec de très longs axones. Le transport axonal est un mécanisme crucial pour la santé de MN, contribuant à la croissance neuronale, au développement, et à la survie. Nous décrivons une méthode détaillée pour l’utilisation des chambres microfluidiques (MFC) pour le suivi du transport axonal des organites étiquetés fluorescents dans les axones MN. Cette méthode est rapide, relativement peu coûteuse, et permet la surveillance des indices intracellulaires dans l’espace et le temps. Nous décrivons un protocole étape par étape pour : 1) Fabrication de MFC en polydiméthylsiloxane (PDMS); 2) Le plating des explantations ventrales de moelle épinière et de la culture dissociée de MN dans les CFC ; 3) Étiquetage des mitochondries et des compartiments acides suivis de l’imagination confocale vivante; 4) Analyse de transport axonal manuelle et semi-automatique. Enfin, nous démontrons une différence dans le transport des mitochondries et des compartiments acides de HB9::GFP ventrale moelle épinière explant axones comme une preuve de la validité du système. Au total, ce protocole fournit un outil efficace pour étudier le transport axonal de divers composants axonaux, ainsi qu’un manuel simplifié pour l’utilisation de MFC pour aider à découvrir les possibilités expérimentales spatiales.
Introduction
Les MN sont des cellules fortement polarisées avec de longs axones, atteignant jusqu’à un mètre de long chez les humains adultes. Ce phénomène crée un défi critique pour le maintien de la connectivité et de la fonction MN. Par conséquent, les MN dépendent d’un bon transport d’informations, d’organites et de matériaux le long des axones de leur corps cellulaire à la synapse et au dos. Divers composants cellulaires, tels que les protéines, l’ARN et les organites, sont transportés régulièrement à travers les axones. Les mitochondries sont des organites importants qui sont systématiquement transportés dans les MN. Les mitochondries sont essentielles pour une activité et une bonne fonction des MN, responsables de la fourniture de l’ATP, de la mise en mémoire tampon du calcium et des processus de signalisation1,,2. Le transport axonal des mitochondries est un processus bien étudié3,4. Intéressant, des défauts dans le transport mitochondrial ont été rapportés pour être impliqués dans plusieurs maladies neurodégénératives et spécifiquement dans les maladies de MN5. Les compartiments acides servent d’autre exemple pour les organites intrinsèques qui se déplacent le long des axones MN. Les compartiments acides comprennent les lysosomes, les endosomes, l’appareil trans-Golgi, et certaines vésicules sécrétrices6. Des défauts dans le transport axonal des compartiments acides ont été trouvés dans plusieurs maladies neurodégénératives aussi bien7, et les articles récents soulignent leur importance dans les maladies de MN8.
Pour étudier efficacement le transport axonal, les chambres microfluidiques qui séparent les compartiments somatiques et axonaux sont fréquemment utilisées9,10. Les deux avantages significatifs du système microfluidique, et la compartimentation et l’isolement des axones, le rendent idéal pour l’étude des processus subcellulaires11. La séparation spatiale entre les corps des cellules neuronales et les axones peut être utilisée pour manipuler les environnements extracellulaires de différents compartiments neuronaux (p. ex., axones vs soma). Les essais biochimiques, neuronaux de croissance/dégénérescence et d’immunofluorescence bénéficient tous de cette plate-forme. Les IMF peuvent également aider à étudier la communication de cellule à cellule en cocultant des neurones avec d’autres types de cellules, tels que les muscles squelettiques12,13,14.
Ici, nous décrivons un protocole simple mais précis pour surveiller les mitochondries et le transport de compartiment acide dans les neurones moteurs. Nous montrons en outre l’utilisation de cette méthode en comparant le pourcentage relatif d’organites mobiles rétrogrades et antérgrades, ainsi que la répartition de la vitesse de transport.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons un système pour suivre le transport axonal des mitochondries et des compartiments acides dans les neurones moteurs. Cette plate-forme in vitro simplifiée permet un contrôle précis, la surveillance et la manipulation des compartiments neuronaux subcellulaires, permettant l’analyse expérimentale des fonctions locales des neurones moteurs. Ce protocole peut être utile pour étudier les maladies de MN telles que la SLA, pour se concentrer sur la compréhension du mécanisme sous-jac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Fondation israélienne pour la science (ISF, 561/11) et du Conseil européen de recherches (ERC, 309377).
Materials
| 35mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD35-100 | |
| 50mm Fluodish – glass bottom dish | World Precision Instruments WPI | FD5040-100 | |
| Andor iXon DU-897 EMCCD camera | Andor | ||
| ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) | Sigma-Aldrich | C1768 | stock of 2mM in filtered DDW |
| B-27 Supplement (50X) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Biopsy punch 1.25mm | World Precision Instruments WPI | 504530 | For preperation of large MFC |
| Biopsy punch 6mm | World Precision Instruments WPI | 504533 | For preperation of small MFC |
| Biopsy punch 7mm | World Precision Instruments WPI | 504534 | For preperation of large MFC |
| Bitplane Imaris software – version 8.4.1 | Imaris | ||
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | #A3311-100G | 5% w/v in ddw |
| Chlorotrimetylsilane | Sigma-Aldrich | #386529-100ML | |
| CNTF | Alomone Labs | C-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Density Gradient Medium – Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN-25 | stock 10mg/mL in neurobasal |
| Dow Corning High-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | For epoxy mold preperation |
| DPBS 10X | Thermo Fisher | #14200-067 | dilute 1:10 in ddw |
| Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm | F.S.T | 1125520 | |
| Epoxy Hardener | Trias Chem S.R.L | IPE 743 | For epoxy mold preperation |
| Epoxy Resin | Trias Chem S.R.L | RP 026UV | For epoxy mold preperation |
| FIJI software | ImageJ | ||
| GDNF | Alomone Labs | G-240 | Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA) |
| Glutamax 100X | Thermo Fisher | #35050-038 | |
| HB9:GFP mice strain | Jackson Laboratories | 005029 | |
| HBSS 10X | Thermo Fisher | #14185-045 | Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter |
| iQ software | Andor | ||
| Iris scissors, curved, 10 cm | AS Medizintechnik | 11-441-10 | |
| Iris scissors, straight, 9 cm | AS Medizintechnik | 11-440-09 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | #L-2020 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Thermo Fisher | 11415064 | |
| LysoTracker Red | Thermo Fisher | L7528 | |
| Mitotracker Deep-Red FM | Thermo Fisher | M22426 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Nikon Eclipse Ti micorscope | Nikon | ||
| Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution | Biological Industries | 03-031-1 | |
| Poly-L-Ornithin (PLO) | Sigma-Aldrich | #P8638 | Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Corning Corporation | #3097358-1004 | |
| Trypsin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | T1426 | stock 25 mg/mL in 1XPBS |
| Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade | F.S.T | 15000-00 | |
| Yokogawa CSU X-1 | Yokogawa |
References
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