En 3D sfäroid modell för Glioblastoma

Summary

Här beskriver vi en lätt att använda invasionsanalys för glioblastom. Denna analys är lämplig för glioblastom stamceller-liknande celler. Ett fijitenma makro för enkel kvantifiering av invasion, migration och spridning beskrivs också.

Abstract

Tvådimensionella (2D) cell kulturer inte efterlikna in vivo tumör tillväxt tillfredsställande. Därför utvecklades tredimensionella (3D) kultur sfäroid modeller. Dessa modeller kan vara särskilt viktiga inom neuro-onkologi. Faktum är att hjärntumörer har en tendens att invadera den friska hjärnmiljön. Vi beskriver häri en idealisk 3D glioblastoma sfäroid-baserade analys som vi utvecklat för att studera tumör invasion. Vi tillhandahåller alla tekniska detaljer och analysverktyg för att framgångsrikt utföra denna analys.

Introduction

I de flesta studier med primära eller kommersiellt tillgängliga cellinjer utförs analyser på celler som odlas på plastytor som monolagerkulturer. Hantera cellkultur i 2D representerar nackdelar, eftersom det inte efterliknar en in vivo 3D-cellmiljö. I 2D-kulturer är hela cellytan direkt i kontakt med mediet, förändrar celltillväxt och ändrar läkemedelstillgänglighet. Dessutom utlöser den ickefysiologiska plastytan celldifferentiering¹. Tredimensionella kulturmodeller har utvecklats för att övervinna dessa svårigheter. De har fördelen av att härma den flercelliga arkitekturen och heterogeniteten hos tumörer², och kan därför anses vara en mer relevant modell för solida tumörer³. Den komplexa morfologi av sfäroider bidrar till att bättre utvärdera läkemedlet penetrance och resistens⁴. Tumören heterogenitet i sfäroiden påverkar spridningen av syre och näringsämnen, och svaret på farmakologiska medel (figur 1A). Diffusion av syre ändras när sfäroidstorleken når 300 μm, vilket leder till en hypoxisk miljö i mitten av sfäroiden (figur 1A,C). Metaboliter är också mindre genomträngande genom cellskikten och kompensera metaboliska reaktioner sker⁵. När diametern på sfäroiden ökar, nekrotiska kärnor kan observeras, ytterligare härma egenskaper som finns i många fasta cancerformer, inklusive den aggressiva hjärncancer glioblastoma (GBM)⁶.

Flera 2D eller 3D invasion analyser för glioblastoma har rapporterats i litteraturen^7,8. Tvådimensionella analyser är främst avsedda för att studera invasion i ett horisontellt plan på ett tunt matrisskikt eller i en Boyden kammare analys⁹. Tredimensionella analyser har beskrivits med 3D sfäroid kulturer med klassisk glioblastoma cellinjer¹⁰. Mer komplexa varianter representeras av invasion av hjärnan organoider av tumör sfäroider i konfrontation kulturer¹¹. Det är dock fortfarande viktigt att utveckla en lätt att använda och reproducerbara analyser tillgängliga för alla laboratorium. Vi har utvecklat ett protokoll för att generera glioblastoma stamceller från patientprover. Kvantifieringen av dessa analyser är lätt hanterbar och kräver endast öppen online-programvara. Kortfattat skärs tumörbitar i små bitar och enzymmatiskt smält. Enstaka celler som härrör från matsmältningen odlas i neurobasal medium. Efter 4-7 dagar bildas sfäriska strukturer spontant. Vid intrakraniell implantation i möss modeller, de bildar tumörer uppvisar en nekrotisk kärna omgiven av pseudo-palisading celler¹². Detta liknar nära de egenskaper som finns i GBM patienter.

I den här artikeln beskriver vi vårt protokoll för att producera sfäroider från ett fastställt antal celler för att säkerställa reproducerbarhet. Två kompletterande matriser kan användas för detta ändamål: Matrigel och kollagen typ I. Matrigel är berikad i tillväxtfaktorer och härmar däggdjur basala membran som krävs för cellen fastsättning och migration. Å andra sidan, kollagen typ I, ett strukturellt inslag av stroma, är den vanligaste fibrillary extracellulär matris och används i cell invasion analyser. Häri illustrerar vi vår GBM sfäroid modell genom att utföra migration och spridning analyser. Analys gjordes inte bara vid fasta tidpunkter utan också genom att övervaka sfäroid expansion och cell rörelse av levande bildbehandling. Dessutom gjordes elektronmikroskopi för att visualisera morfologiska detaljer.

Protocol

Informerat skriftligt medgivande erhölls från alla patienter (från Haukeland Hospital, Bergen, Norge enligt lokala etiska kommittébestämmelser). Vårt protokoll följer riktlinjerna i vår institutions kommitté för mänsklig forskningik. 1. Generering av enhetlig storlek tumör sfäroider OBS: Stamceller-liknande celler odlas i neurobasal medium kompletteras med B27 tillägg, heparin, FGF-2, penicillin, och streptomycin, som beskrivs i tidigare artiklar<sup cla…

Representative Results

Sfäroider utarbetades som beskrivs i protokoll avsnitt och observationer gjordes om migration, invasion, spridning och mikroskopi. För att mäta hypoxi i olika områden av sfärisk struktur användes karboxad anhydras IX-färgning för att bestämma hypoxisk aktivitet (figur 1A-C). Fler CAIX-positiva celler observerades i sfäroidcentrum (figur 1A-C). Hypoxiska celler som ligger i sfäroidkärn…

Discussion

Tumör sfäroid analyser är väl anpassade för att studera tumör egenskaper inklusive spridning, invasion, och migration, samt celldöd och läkemedelsrespons. Cancerceller invaderar 3D-matrisen och bildar en invasiv mikrotumör, vilket ses i figur 4B,C. Under den invasiva processen kan matrismetalloproteinaser (MMP) smälta matriser kring tumörceller¹³och MMP-hämmare (t.ex.¹⁴ Migration och invasion innebär överlappande …

Materials

96 well round-bottom plate	Falcon	08-772-212
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at 4 °C, sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
DPBS 10X	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm2	Falcon	10497302
Matrigel	Corning	354230	Stored at -20 °C, diluted to a final concentration of 0.2 mg/mL in cold NBM
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
NBM	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Neurobasal medium	Gibco	21103049	Stored at 4 °C
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used to cell counting
Type I Collagen	Corning	354236	Stored at 4 °C