Análise de Citometria de Fluxo de Subconjuntos de Células Imunes dentro do Baço de Murina, Medula Óssea, Linfonodos e Tecido Sinovial em um Modelo de Osteoartrite

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado e reprodutível de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de monócito/macrófago e células T usando ensaios de coloração extra e intracelular dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial, utilizando um modelo cirúrgico estabelecido de osteoartrite de murina.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes, afetando pacientes que sofrem de dor e limitações físicas. Evidências recentes indicam um potencial componente inflamatório da doença, com células T e monócitos/macrófagos potencialmente associados à patogênese de OA. Outros estudos postularam um papel importante para subconjuntos de ambas as linhagens celulares inflamatórias, como linfócitos de th1, th2, th17 e t-regulatory, e M1, M2, e macrófagos residentes em tecido sinovium. No entanto, a interação entre a resposta celular inflamatória sinovial local e sistêmica e as mudanças estruturais na articulação é desconhecida. Para entender perfeitamente como as células T e os monócitos/macrófagos contribuem para o OA, é importante ser capaz de identificar quantitivamente essas células e seus subconjuntos simultaneamente em tecido sinovial, órgãos linfáticos secundários e sistematicamente (o baço e a medula óssea). Hoje em dia, os diferentes subconjuntos de células inflamatórias podem ser identificados por uma combinação de marcadores de superfície celular tornando a citometria de fluxo multicolorida uma técnica poderosa na investigação desses processos celulares. Neste protocolo, descrevemos etapas detalhadas relativas à colheita de tecido sinovial e órgãos linfáticos secundários, bem como a geração de suspensões de células únicas. Além disso, apresentamos um ensaio de coloração extracelular para identificar monócitos/macrófagos e seus subconjuntos, bem como um ensaio de coloração extra e intracelular para identificar células T e seus subconjuntos dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial. Cada etapa deste protocolo foi otimizada e testada, resultando em um ensaio altamente reprodutível que pode ser utilizado para outros modelos de camundongos OA cirúrgicos e não cirúrgicos.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença debilitante e dolorosa que envolve várias patologias de todos os tecidos associados à articulação¹. Afetando aproximadamente 3,8% da população global², o AA é uma das doenças musculoesqueléticos mais prevalentes e deve se tornar a^4ª principal causa de incapacidade em todo o mundo até 2020³. OA pós-traumático ocorre após uma lesão articular e representa pelo menos 12% de todos os OA e até 25% de OA em articulações suscetíveis como o joelho^4,,5. Além disso, a lesão articular aumenta o risco de vida....

Protocolo

O Comitê de Ética Animal do Distrito Sanitário Local de Sydney aprovou todos os procedimentos mencionados neste protocolo. Os camundongos são alojados e cuidados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Para todos os experimentos de 10 a 12 semanas de idade, foram utilizados camundongos C57BL/6 masculinos.

NOTA: Para induzir o OA pós-traumático, foi realizada a desestabilização cirúrgica do menisco medial (DMM) na articulação de sufocamento direito. Informações detalhadas sobre este modelo animal foram publicadas por Glasson....

Resultados

Os resultados representativos do painel de subconjunto de monócito e do painel de subconjunto de células T são descritos abaixo.

A Figura 1 ilustra a estratégia hierárquica de gating para o painel de subconjunto de monócitos em células imunes recolhidas da medula óssea de animais tratados com DMM. A mesma estratégia foi utilizada e verificada em todos os outros tipos de tecidos. Ao configurar o experimento, a tensão de Área de Dispersão Para a Frente (FSC-A) e Áre.......

Discussão

Os métodos descritos neste protocolo foram projetados e testados para identificar de forma confiável vários subconjuntos de monócitos/macrófagos e células T dentro do baço de murina, medula óssea, linfonodos e tecido sinovial em um modelo de murina de osteoartrite (OA). O protocolo atual pode ser facilmente modificado para investigar diferentes tipos de tecidos, ou outros tipos de células, trocando anticorpos, e pode ser usado para modelos murinos alternativos de OA. Ao testar outros tipos de tecidos, é fundamental testa.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
APC anti-mouse CD194 (CCR4)	BioLegend	131212	Painel de Células T
Brilhante Buffer de Manchas Plus 1000Tst	BD		566385 Buffers
Viabilidade Fixável Mancha 510, 100 µ g	BD	564406	Painel de Células
T Fixável Mancha de Viabilidade 510, 100 µ g	BD	564406	Painel de Monócitos
Liberase, Grau de Pesquisa	Roche	5401127001	Enzima para tecido sinovial
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 µ g	BD	564985	Painel de Monócitos
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µ g	BD	562454	Painel de Monócitos
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µ g	BD	742274	Painel de Células T
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µ g	BD	565250	Painel de Monócitos
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µ g	BD	563061	Painel de Células T
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 µ g	BD	557596	Painel de Células T
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 µ g	BD	552775	Painel de Células T
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 µ g	BD	565480	Painel de Células T
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µ g	BD	565261	Painel de Células T
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 µ g	BD	740664	Painel de Células T
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 µ g	BD	563687	Painel de Monócitos
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 µ g	BD	563332	Painel de Células T
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 µ g	BD	565411	Painel de Monócitos
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µ g	BD	560408	Painel de Células T
MS I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µ g	BD	563414	Painel de Monócitos
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ g	BD	560593	Painel de Monócitos
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µ g	BD	560600	Painel de Monócitos
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µ g	BD	564143	Painel de Células T
MS ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µ g	BD	562894	Painel de células T
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	N / A	N / A	Tampões Conjunto de
buffer de fator de transcrição 100Tst	BD	562574	Buffers