En flaskehals i “design-build-test” syklus av mikrobiell engineering er hastigheten som vi kan utføre funksjonelle skjermer av stammer. Vi beskriver en høygjennomstrømningsmetode for belastningsscreening brukt på hundrevis til tusenvis av gjærceller per eksperiment som benytter dråpebasert RNA-sekvensering.
De kraftige verktøyene som er tilgjengelige for å redigere gjærgenomer har gjort denne mikroben til en verdifull plattform for prosjektering. Mens det nå er mulig å konstruere biblioteker av millioner av genetisk forskjellige stammer, screening for en ønsket fenotype er fortsatt et betydelig hinder. Med eksisterende screeningteknikker er det en avveining mellom informasjonsutgang og gjennomstrømning, med høy gjennomstrømningsscreening som vanligvis utføres på ett produkt av interesse. Derfor presenterer vi en tilnærming til akselerere belastningscreening ved å tilpasse enkeltcelle RNA sekvensering til isogene picoliter kolonier av genmodifiserte gjærstammer. For å løse de unike utfordringene ved å utføre RNA sekvensering på gjærceller, dyrker vi isogene gjærkolonier i hydrogeler og spheroplast før vi utfører RNA-sekvensering. RNA sekvensering serutring data kan brukes til å utlede gjær fenotyper og sortere ut konstruerte veier. Skalerbarheten av vår metode løser en kritisk hindring i mikrobiell engineering.
Et primært mål med mikrobiell engineering er å endre mikrober for å indusere dem til å produsere verdifulle forbindelser1,2. S. cerevisiae har vært den primære organismen for mikrobiell engineering på grunn av sin enkle kultur og bredden av verktøy tilgjengelig for å konstruere sitt genom3,4,5. Imidlertid gjenstår et hinder i å utføre funksjonelle skjermer på den modifiserte gjæren: screening gjennomstrømning henger bak genomteknikk etter størrelsesordener. Screening innebærer vanligvis isolere stammer i mikrobrønnplater og fenotyping dem ved å måle produksjonen av en bestemt forbindelse6,7. Gjennomstrømningen av denne prosessen er begrenset av de store mengdene reagens som trengs for å si individuelle stammer i hundre mikroliterreaksjoner. Dråpemikrofluidikk gir en attraktiv løsning for å øke gjennomstrømningen av gjærscreening etter størrelsesorden ved å nedskalere reaksjoner som normalt utføres i brønnplater8. Men, som med godt plateskjermer, droplet skjermer vanligvis oppdage enkelt produkt forbindelser, som gir begrenset informasjon i den globale funksjonen til den konstruerte veien9,10,11.
RNA sekvensering (RNA-seq) kan muliggjøre mer omfattende karakterisering av veidrift ved å tillate uttrykksnivåer av alle relevante gener som skal vurderes samtidig12,13. Videre tillater dråpemetoder tusenvis av celler å bli profilert per eksperiment, noe som gir gjennomstrømningen som er nødvendig for å screene biblioteker av konstruerte varianter14,15. RNA-seq-metoder er imidlertid optimalisert for pattedyrceller; gjær, til sammenligning, har mindre mRNA per celle og en cellevegg som er vanskelig å fjerne16, utelukker deres sekvensering ved eksisterende metoder. Hvis en høy gjennomstrømningsdråpemetode kunne utarbeides for å muliggjøre gjær RNA-seq, ville det gi en skalerbar, kostnadseffektiv og informasjonsrik fenotypingplattform for gjærteknikk.
Vi presenterer en detaljert protokoll av vår nylig utviklede metode for sekvensering av gjærceller ved hjelp av høy gjennomstrømningsdråpemikrofluidics17. For å overvinne utfordringen med begrenset RNA, innkapsler vi og kultur enkeltgjærceller i picoliter hydrogelsfærer. Kultur dupliserer cellene, noe som gir hundrevis av kopier som deler den samme konstruerte veien; dette reduserer variasjonen på grunn av encellede genuttrykk, samtidig som det øker mengden RNA som er tilgjengelig for sekvensering betydelig. Etter kulturbasert forsterkning spheroplast vi cellene, fjerne celleveggen via bulk enzymatisk fordøyelse. Cellemembraner forblir intakte, slik at hver isogene koloni og tilhørende mRNA forblir innkapslet i hydrogelsfærene sine. Dette gjør at vi kan pare de enkelte koloniene med mRNA-fangstreagenser og lysisbuffer, og mRNA som skal fanges, strekkodes og sekvenseres etter Drop-Seq-arbeidsflyten14. Vår metode tillater transkripsjonsomfattende screening av tusenvis av isogene gjærkolonier per eksperiment.
Vår metode for isogene gjærkoloni RNA sekvensering (ICO-seq) tilpasser en publisert enkeltcelle RNA sekvenseringsplattform, Drop-Seq, for høy gjennomstrømning screening av konstruertgjær stammer. Gjærceller inneholder mindre enn 10% av kopiene av mRNA av en typisk pattedyrcelle og har en cellevegg som må degraderes før mRNA-fangst16. Disse to faktorene utelukker direkte bruk av gjær til Drop-Seq eller andre dråpebaserte scRNA-seq-plattformer. For å løse disse problemene innkapsler vi enkeltceller i hydrogeler og vokser dem til kolonier for å gi nok inngangsmateriale til RNA-sekvensering, og vi fordøyer gjærcelleveggen for å generere spheroplast før lysis og mRNA-fangst. Disse endringene legger til ekstra kompleksitet i ICO-seq-arbeidsflyten sammenlignet med den opprinnelige Drop-Seq-arbeidsflyten, og er kritiske trinn som brukerne må sikre at du fortsetter jevnt.
Riktig drift av enhet A er nødvendig for innkapsling av enkeltgjærceller i agarosehydrogeler. Riktig telling av inngangsgjærsuspensjonen må følges for å minimere antall hydrogeler med mer enn én gjærcelle, samtidig som det sikrer at nok hydrogeler inneholder en enkelt celle for å sikre en rimelig cellefangsteffektivitet under mRNA-fangst. Under bruk av mikrofluidiske enheter må agarosegelblandingen være godt oppløst og passert gjennom et sprøytefilter for å minimere sjansen for tilstopping av enheten. Agarose gelblandingen er viskøs og regionen der en enkelt kanal deler seg i åtte er spesielt utsatt for tilstopping. Ved å sentrere et høyhastighetskamera for å visualisere enhetsdrift i den regionen av enheten, kan brukerne overvåke ensartethetav dråper som kommer fra hver av de åtte kanalene og raskt reagere hvis ensartetheten endres på grunn av tresko i noen av kanalene. Inspeksjon av en liten mengde innsamlet emulsjon under mikroskopet gir en sekundær metode for å bekrefte en høy kvalitet emulsjon.
Etter vekst av gjærkolonier i hydrogeler, er det nødvendig med flere forholdsregler for å sikre kvalitet mRNA-ekstraksjon på enkelt koloninivå. Det er viktig å optimalisere tiden gjær er i hydrogelkultur, fordi hvis gjæren blir igjen i kultur for lenge, vil mange unnslippe hydrogelenes begrensninger, noe som fører til et høyere bakgrunnssignal under RNA-sekvensering og lavere følsomhet når de diskriminerer mellom celletyper. Riktig generering av spheroplast ved hjelp av Zymolyase sikrer at mRNA vil bli utgitt etter celleeksponering for lysisbuffer. Visuell inspeksjon av gjærkolonier etter Zymolyase bør gi blankere gjærceller. Feil celleveggfordøyelse vil føre til lavere RNA-fangsteffektivitet. Til slutt bør hydrogelene være tettpakket når de injiseres i enhet B. Overvåking av hydrogelinngangen med et høyhastighetskamera vil tillate opphør av emulsjonsinnsamling når hydrogelene ikke lenger er tettpakket ved inndata i enheten, ellers vil fangsteffektiviteten bli påvirket.
En potensiell bekymring med vår metode er at mikrogelkultur av gjær kan vesentlig endre genuttrykk. Tidligere arbeid med å undersøke gjærgenuttrykk i mikrogeler og agar viser forskjeller i genuttrykksgjennomsnitt, men samlet sett en positiv korrelasjon17, selv om videre utredning av denne påstanden om en rekke gjærstammer er forsvarlig. Metoden har også begrenset cellefangsteffektivitet på grunn av stokastisk lasting av mRNA fange perler etter Poisson statistikk14. For tiden inneholder ca 10% av dråpene en perle og en koloni, og frekvensen av doble innkapslingsmidler forventes å være under 1%. Doble innkapslinger fører til forvirrende elementer under RNA-seq dataanalyse og deres filtrering forblir utfordrende23; en fangstrate på 25 % vil føre til en tilsvarende økning av doble innkapslinger til 5 % (Tilleggstall 2). Selv om vi demonstrerer ICO-seq ved hjelp av Drop-Seq-plattformen, er det andre droplet RNA-seq plattformer som introduserer mRNA fange perler deterministisk snarere enn statistisk, for eksempel kommersielt tilgjengelig 10x Genomics Chromium plattform15,24. Integreringen av disse plattformene med ICO-seq kan øke fangsteffektiviteten utover hva Poisson-statistikk tillater. Til slutt er en grunnleggende begrensning av droplet RNA-seq manglende evne til å gjenopprette celler av interesse etter sekvensering. Denne begrensningen bør tas i betraktning når du vurderer hvilke typer gjærbiblioteker som skal analyseres ved hjelp av denne metoden.
Cell-to-cell heterogenitet har blitt demonstrert på klonalt nivå for mikrober som E. coli25 og S. cerevisiae26 avslører nye celle sier at en bulk-nivå analyse ellers ville maskere. Bulk RNA-seq analyser utført på C. albicans har en tendens til å enten se på populasjonsomfattende transkripsjonsendringer, eller hvite og ugjennomsiktige celler som to separate populasjoner27,28. Anvendelsen av ICO-seq kan føre til oppdagelsen av flere understater og gi et analytisk rammeverk for å oppdage nye cellestater innenfor andre gjærarter. Veksten av celler i hydrogeler er imidlertid ikke begrenset til gjær: andre celletyper, som pattedyr, bakterielle og andre soppceller kan også dyrkes i hydrogeler29,30. Sekvenseringen av isogene kolonier versus enkeltceller fører til at det snittes av biologisk støy på grunn av celle-til-celle-variasjon, noe som forbedrer diskrimineringmellom celletyper. Dette kan hjelpe når du analyserer celler der genetisk mangfold sentrerer seg om spesifikke synteseveier. De utvidede mulighetene for celletypeinngang til ICO-seq og dens potensielle integrasjon med kommersielt tilgjengelige droplet RNA-seq plattformer posisjonerer ICO-seq som en lovende plattform for dissekering av cellulær heterogenitet på genetisk nivå.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av National Science Foundation Career Award DBI-1253293, National Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 og gi R01HG008978, National Science Foundation Technology Center gi DBI-1548297, og UCSF Center for Cellular Construction. ARA og ZJG er Chan-Zuckerberg Biohub-etterforskere.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |