सी एलिगेंस में भागा पेप्टाइड विषाक्तता को मापने
Summary
दोहराने से जुड़े गैर-एटीजी-निर्भर ट्रांसलेशनल उत्पाद कई दोहराने विस्तार आधारित बीमारियों की रोगजनक विशेषताएं उभर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल का लक्ष्य मॉडल सिस्टम सी एलिगेंसमें व्यवहार और सेलुलर परखों का उपयोग करके इन पेप्टाइड्स के कारण विषाक्तता का मूल्यांकन करना है।
Abstract
सी एलिगेंस का उपयोग आमतौर पर उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को मॉडल करने के लिए किया जाता है, जो दोहराने वाले विस्तार उत्परिवर्तनों के कारण होते हैं, जैसे एम्योट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) और हंटिंगटन की बीमारी। हाल ही में, दोहराने विस्तार युक्त आरएनए को दोहराने से जुड़े गैर-अगस्त-निर्भर (आरएएन) अनुवाद नामक प्रोटीन अनुवाद के एक उपन्यास प्रकार के लिए सब्सट्रेट दिखाया गया था। विहित अनुवाद के विपरीत, भागा अनुवाद को स्टार्ट कोडन की आवश्यकता नहीं होती है और केवल तभी होता है जब दोहराता है एक सीमा लंबाई से अधिक होता है। क्योंकि पढ़ने के फ्रेम को निर्धारित करने के लिए कोई शुरुआत कोडन नहीं है, भागा अनुवाद भावना और एंटीसेंस आरएनए टेम्पलेट्स दोनों से सभी रीडिंग फ्रेम में होता है जिसमें दोहराने वाला विस्तार अनुक्रम होता है। इसलिए, भागा अनुवाद संभावित रोग से जुड़े विषाक्त पेप्टाइड्स की संख्या को एक से छह तक बढ़ाता है। इस प्रकार अब तक, भागा अनुवाद आठ अलग-अलग दोहराने विस्तार आधारित न्यूरोडीजेनेरेटिव और न्यूरोमस्कुलर रोगों में प्रलेखित किया गया है। प्रत्येक मामले में, यह समझना कि कौन से उत्पाद जहरीले हैं, साथ ही विषाक्तता के उनके तंत्र, यह समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है कि ये पेप्टाइड्स रोग रोग विज्ञान में कैसे योगदान देते हैं। इस पेपर में, हम मॉडल सिस्टम सी एलिगेंस में आरएएन पेप्टाइड्स की विषाक्तता को मापने के लिए रणनीतियां प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, हम सी एलिगेंसके विकास और गतिशीलता पर RAN पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं । दूसरा, हम गतिशीलता पर भागा पेप्टाइड्स के पोस्टडेवलपमेंटल, आयु-निर्भर प्रभावों को मापने के लिए एक परख का विस्तार करते हैं। अंत में, हम न्यूरॉन आकृति विज्ञान पर आरएएन पेप्टाइड्स के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक न्यूरोटॉक्सिकपरेपन का वर्णन करते हैं। ये परखों से आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता का व्यापक आकलन प्रदान किया जाता है और रोग तंत्र या उपचारों की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक या छोटे अणु स्क्रीन प्रदर्शन के लिए उपयोगी हो सकता है।
Introduction
डीएनए रिपीट दृश्यों का अनुचित विस्तार कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस), फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (एफटीडी), और हंटिंगटन की बीमारी (एचडी)1के लिए आनुवंशिक आधार है। जबकि इन रोगों के लिए स्थापित सेलुलर और पशु मॉडल हैं, इन स्थितियों में अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से परिभाषित नहीं हैं। उदाहरण के लिए, एचडी हंटिंगटिन प्रोटीनएचटीटी 2के लिए कोडिंग अनुक्रम में कैग दोहराने के अनुक्रम के विस्तार के कारण होता है। क्योंकि कैग अमीनो एसिड ग्लूटामाइन को एन्कोड करता है, सीएजी दोहराता है कि टीएचटी के भीतर पॉलीग्लूटामाइन या पॉलीक्यू, अनुक्रम के सम्मिलन में विस्तार होता है। विस्तारित पॉलीक्यू प्रोटीन लंबाई और उम्र पर निर्भर प्रोटीन समुचित रूप से होता है जो विषाक्तता3,,4से जुड़े होते हैं। आश्चर्य की बात है, हाल के दो अध्ययनों से पता चलता है कि पॉलीक्यू अनुक्रम की लंबाई एचडी रोग की शुरुआत का मुख्य चालक नहीं है, यह सुझाव देते हुए कि पॉलीक्यू-स्वतंत्र कारक भी5,6रोगमें योगदान दे सकते हैं।
एक संभावित पॉलीक्यू-स्वतंत्र तंत्र में एक नए खोजे Aगए प्रकार के प्रोटीन अनुवाद शामिल हैं, जो आरए ए सोशिएट एनऑन-अगस्त-निर्भर (आरएएन) अनुवाद7कहा जाता है। जैसा कि इसका नाम निकलता है, भागा अनुवाद केवल तब होता है जब एक विस्तारित दोहराने वाला अनुक्रम मौजूद होता है और इसके लिए विहित स्टार्ट कोडन की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, भागा अनुवाद दोहराने के सभी तीन पढ़ने के फ्रेम में होता है तीन अलग पॉलीपेप्टाइड्स का उत्पादन करने के लिए। इसके अलावा, क्योंकि कई जीन भी एक एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट का उत्पादन करते हैं जिसमें विस्तारित दोहराने अनुक्रम का रिवर्स पूरक होता है, भागा अनुवाद एंटीसेंस ट्रांसक्रिप्ट के सभी तीन रीडिंग फ्रेम में भी होता है। एक साथ, भागा अनुवाद एक पेप्टाइड से छह पेप्टाइड्स तक विस्तारित दोहराने वाले डीएनए अनुक्रम से उत्पादित प्रोटीन की संख्या का विस्तार करता है। आज तक, भागा अनुवाद कम से कम आठ अलग-अलग दोहराने वाले विस्तार विकारों8में देखा गया है। डॉ . पेप्टाइड्स पोस्टमॉर्टम में मरीज के नमूनों में देखा जाता है और केवल ऐसे मामलों में जहां मरीज का विस्तारित रिपीट9,10होता है . जबकि ये पेप्टाइड्स रोगी कोशिकाओं में स्पष्ट रूप से मौजूद हैं, रोग रोग विज्ञान में उनका योगदान अस्पष्ट है।
आरएएन पेप्टाइड्स से जुड़ी संभावित विषाक्तता को बेहतर ढंग से परिभाषित करने के लिए, कई समूहों ने विभिन्न मॉडल प्रणालियों में प्रत्येक पेप्टाइड व्यक्त किया है, जैसे खमीर, मक्खियों, चूहों और ऊतक संस्कृति कोशिकाओं11,,12,,13,,14,,15,,16। अभिव्यक्ति के लिए दोहराने के अनुक्रम का उपयोग करने के बजाय, ये मॉडल एक कोडन-भिन्नता दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं जिसमें दोहराने का अनुक्रम समाप्त हो जाता है लेकिन अमीनो एसिड अनुक्रम को संरक्षित किया जाता है। अनुवाद दीक्षा एक विहित ATG के माध्यम से होता है और पेप्टाइड आम तौर पर एन या सी-टर्मिनस पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है, जिनमें से न तो भागना पेप्टाइड विषाक्तता के साथ हस्तक्षेप प्रतीत होता है । इसलिए, प्रत्येक निर्माण एक ही भागा पेप्टाइड को ओवरएक्सप्रेस करता है। सरल परख के साथ एक बहुकोशिकीय जीव में विभिन्न भाग उत्पादों मॉडलिंग के लिए सरल परख के साथ RAN पेप्टाइड विषाक्तता को मापने के लिए महत्वपूर्ण है समझने के लिए कैसे प्रत्येक रोग से विभिन्न भाग उत्पादों के कारण दोहराने के विस्तार सेलुलर रोग और न्यूरोडिजेनरेशन के लिए योगदान महत्वपूर्ण है ।
अन्य मॉडल प्रणालियों की तरह, सी एलिगेंस एक लचीला और कुशल प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है जो नए रोग तंत्र के अध्ययन को सक्षम बनाता है, जैसे कि आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता। कीड़े कई अद्वितीय प्रयोगात्मक विशेषताएं प्रदान करते हैं जो वर्तमान में आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता के अन्य मॉडलों में उपलब्ध नहीं हैं। सबसे पहले, सी एलिगेंस जन्म से मृत्यु तक ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी होते हैं। यह RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण के सरल दृश्य के साथ-साथ जीवित जानवरों में न्यूरोडिजेनरेशन के वीवो विश्लेषण में अनुमति देता है। दूसरा, RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति मॉडल पैदा करने के लिए ट्रांसजेनिक तरीके सस्ती और तेज हैं। सी एलिगेंसके छोटे तीन दिवसीय जीवन चक्र को देखते हुए, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों को एक सेल प्रकार विशिष्ट तरीके से किसी भी दिया गया आरएएन पेप्टाइड को व्यक्त करने के लिए एक सप्ताह के तहत उत्पादित किया जा सकता है । तीसरा, सरल फेनोटाइपिक आउटपुट को आनुवंशिक स्क्रीनिंग विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है, जैसे रासायनिक म्यूटाजेनेसिस या आरएनएआई स्क्रीनिंग, तेजी से RAN पेप्टाइड विषाक्तता के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए। अंत में, सी एलिगेंस (~ 20 दिनों) की छोटी उम्र जांचकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति देती है कि उम्र बढ़ने कैसे, जो सबसे दोहराने वाले विस्तार रोगों के लिए सबसे बड़ा जोखिम कारक है, भागा पेप्टाइड विषाक्तता को प्रभावित करता है। साथ में, प्रयोगात्मक विशेषताओं का यह संयोजन किसी भी अन्य मॉडल प्रणाली में बेजोड़ है और आरएएन पेप्टाइड विषाक्तता के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है।
यहां हम कई परखों का वर्णन करते हैं जो आरएएन पेप्टाइड्स की विषाक्तता को मापने और इस विषाक्तता के आनुवंशिक संशोधकों की पहचान करने के लिए सी एलिगेंस के प्रायोगिक फायदों का लाभ उठाते हैं। कोडन-विविध एटीजी-शुरू किए गए आरएएन पेप्टाइड्स को जीएफपी के साथ टैग किया जाता है और मायो-3 प्रमोटर के तहत या यूएनसी-47 प्रमोटर के तहत गैबार्गिक मोटर न्यूरॉन्स में व्यक्तिगत रूप से व्यक्त किया जाता है। मांसपेशियों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि विषाक्त RAN पेप्टाइड्स को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) टैग के साथ टैग किया जाता है जिसे आरएनएआई फीडिंग वेक्टर के साथ लक्षित किया जा सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विषाक्त भागा पेप्टाइड अभिव्यक्ति आमतौर पर विकास को अवरुद्ध करती है, इस तरह के उपभेदों को अव्यवहार्य प्रदान करती है। जीएफपी (आरएनएआई) का उपयोग सशर्त RAN पेप्टाइड अभिव्यक्ति को निष्क्रिय करता है और तनाव रखरखाव, आनुवंशिक क्रॉस आदि की अनुमति देता है। परखों के लिए, इन जानवरों को जीएफपी (आरएनएआई)से हटा दिया जाता है, जो आरएएन पेप्टाइड और परिणामस्वरूप फेनोटाइप की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है। कोडन-विविध भागा पेप्टाइड अभिव्यक्ति निर्माण डिजाइन करने के लिए आणविक रणनीति के अलावा, हम विकासात्मक विषाक्तता (लार्वा गतिशीलता और विकास परख), विकासके बाद की उम्र से जुड़ी विषाक्तता (पक्षाघात परख), और न्यूरॉन रूपात्मक दोषों (संजीदगी परख) को मापने के लिए परखों का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम उन तरीकों की रिपोर्ट करते हैं जिनका उपयोग मांसपेशियों में मॉडलिंग या सी एलिगेंसके न्यूरॉन्स में की गई रैन पेप्टाइड विषाक्तता को परख ने के लिए किया जा सकता है। जबकि न्यूरोडीजेनेरेटिव प्रोट…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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