Mätning ran peptid toxicitet i C. elegans
Summary
Upprepade-associerade icke-ATG-beroende translationella produkter är nya patogena funktioner i flera upprepa expansion-baserade sjukdomar. Målet med det protokoll som beskrivs är att utvärdera toxicitet orsakad av dessa peptider med hjälp av beteendemässiga och cellulära analyser i modellsystemet C. elegans.
Abstract
C. elegans används ofta för att modellera åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som orsakas av upprepade expansionsmutationer, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och Huntingtons sjukdom. Nyligen upprepade expansion-innehållande RNA visade sig vara substratet för en ny typ av protein översättning kallas upprepa-associerade icke-AUG-beroende (RAN) översättning. Till skillnad från kanonisk översättning kräver RAN-översättning inte en startkodon och inträffar endast när repetitionerna överskrider en tröskellängd. Eftersom det inte finns någon startkodon för att bestämma läsramen sker RAN-översättning i alla läsramar från både sense- och antisense RNA-mallar som innehåller en upprepningsexpansionssekvens. Därför utökar RAN översättning antalet möjliga sjukdomsrelaterade toxiska peptider från en till sex. Hittills har RAN översättning dokumenterats i åtta olika upprepa expansion-baserade neurodegenerativa och neuromuskulära sjukdomar. I varje enskilt fall är dechiffrera vilka RAN-produkter som är giftiga, liksom deras mekanismer för toxicitet, ett kritiskt steg mot att förstå hur dessa peptider bidrar till sjukdomens patofysiologi. I detta dokument presenterar vi strategier för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider i modellsystemet C. elegans. Först beskriver vi förfaranden för att mäta RAN peptid toxicitet på tillväxt och motilitet att utveckla C. elegans. För det andra beskriver vi en analys för att mäta postdevelopmental, åldersberoende effekter av RAN peptider på motilitet. Slutligen beskriver vi en neurotoxicitet analys för att utvärdera effekterna av RAN peptider på neuron morfologi. Dessa analyser ger en bred bedömning av RAN peptid toxicitet och kan vara användbara för att utföra storskaliga genetiska eller små molekyler skärmar för att identifiera sjukdomsmekanismer eller terapier.
Introduction
Den olämpliga expansionen av DNA-repetitionssekvenser är den genetiska grunden för flera neurodegenerativa sjukdomar såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och Huntingtons sjukdom (HS)1. Även om det finns etablerade cellulära och djurmodeller för dessa sjukdomar, mekanismer bakom dessa villkor är inte väl definierade. Till exempel orsakas HD av expansioner av en CAG-upprepningssekvens i kodningssekvensen för Huntingtin-proteinet Htt2. Eftersom CAG kodar aminosyran glutamin, CAG upprepa expansion resulterar i införandet av en polyGlutamin, eller polyQ, sekvens inom Htt. Expanderade polyQ proteiner bildar längd- och åldersberoende proteinaggregat som är associerade med toxicitet3,4. Överraskande, två nyligen genomförda studier tyder på att längden på polyQ sekvensen inte är den viktigaste drivkraften för HS sjukdom debut, vilket tyder på att polyQ-oberoende faktorer kan också bidra till sjukdomen5,6.
En möjlig polyQ-oberoende mekanism innebär en nyupptäckt typ av proteinöversättning som kallas Repeat Associated Non-AUG-beroende (RAN) översättning7. Som namnet antyder inträffar RAN-översättningen endast när en utökad upprepad sekvens är närvarande och inte kräver en kanonisk start kodon. Därför förekommer RAN-översättning i alla tre läsramarna i upprepningen för att producera tre distinkta polypeptider. Dessutom, eftersom många gener också producerar en antisense avskrift som innehåller den omvända komplement av den utökade upprepa sekvensen, RAN översättning förekommer också i alla tre läsramar av antisense avskrift. Tillsammans utökar RAN översättning antalet proteiner som produceras från en utökad upprepad DNA-sekvens från en peptid till sex peptider. Hittills har RAN översättning observerats i minst åtta olika upprepade expansionsstörningar8. RAN peptider observeras i postmortem patientprover och endast i de fall där patienten bär en utökad upprepa9,10. Medan dessa peptider är tydligt närvarande i patientceller, deras bidrag till sjukdomen patofysiologin är oklart.
För att bättre definiera den potentiella toxicitet som förknippas med RAN peptid, flera grupper har uttryckt varje peptid i olika modellsystem, såsom jäst, flugor, möss, och vävnadsodling celler11,12,13,14,15,16. I stället för att använda upprepningssekvensen för uttryck använder dessa modeller en kodonvariationsmetod där upprepningssekvensen elimineras men aminosyrasekvensen bevaras. Översättning inledande sker genom en kanonisk ATG och peptid är vanligtvis smält till ett fluorescerande protein vid antingen N- eller C-ändstation, varav ingen verkar störa RAN peptid toxicitet. Därför överuttrycker varje konstruktion en enda RAN peptid. Modellering av de olika RAN-produkterna i en flercellig organism med enkla analyser för att mäta RAN-peptidtoxicitet är oerhört viktigt för att förstå hur de olika RAN-produkterna från varje sjukdomsframkallande upprepad expansion bidrar till cellulär dysfunktion och neurodegeneration.
Liksom andra modellsystem erbjuder C. elegans en flexibel och effektiv experimentell plattform som möjliggör studier av nya sjukdomsmekanismer, såsom RAN-peptidtoxicitet. Maskar erbjuder flera unika experimentella attribut som för närvarande inte finns i andra modeller av RAN peptid toxicitet. För det första är C. elegans optiskt transparent från födseln till döden. Detta möjliggör enkel visualisering av RAN peptid uttryck och lokalisering, samt in vivo analys av neurodegeneration hos levande djur. För det andra är transgena metoder för att generera RAN peptiduttrycksmodeller billiga och snabba. Med tanke på C. elegansskorta tredagars livscykel kan stabila transgena linjer som uttrycker en given RAN-peptid på ett specifikt celltypssätt produceras på mindre än en vecka. För det tredje kan enkla fenotypiska utgångar kombineras med genetiska screeningmetoder, såsom kemisk mutagenesis eller RNAi screening, för att snabbt identifiera gener som är väsentliga för RAN peptidtoxicitet. Slutligen, den korta livslängden på C. elegans (~ 20 dagar) tillåter utredare att avgöra hur åldrande, som är den största riskfaktorn för de flesta upprepade expansionssjukdomar, påverkar RAN peptid toxicitet. Tillsammans är denna kombination av experimentella attribut oöverträffad i alla andra modellsystem och erbjuder en kraftfull plattform för studier av RAN peptidtoxicitet.
Här beskriver vi flera analyser som utnyttjar de experimentella fördelarna med C. elegans för att mäta toxiciteten hos RAN-peptider och för att identifiera genetiska modifierare av denna toxicitet. Den kodon-varierade ATG-initierade RAN peptider är märkta med GFP och uttryckt individuellt i antingen muskelceller under myo-3 promotorn eller i GABAergic motor nervceller under unc-47 promotorn. För uttryck i muskelceller är det viktigt att giftiga RAN-peptider är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP), eller andra fluorescerande protein (FP) tagg som kan riktas med en RNAi utfodring vektor. Detta beror på att giftiga RAN peptid uttryck blockerar vanligtvis tillväxt, vilket gör sådana stammar nonviable. Användningen av gfp (RNAi) inaktiverar villkorligt RAN peptid uttryck och tillåter stam underhåll, genetiska kors, etc. För analyser avlägsnas dessa djur från gfp(RNAi),vilket möjliggör uttryck av RAN-peptiden och de resulterande fenotyperna. Förutom den molekylära strategin för att utforma codon-varierade RAN peptid uttryck konstruktioner, beskriver vi analyser för att mäta utvecklingsmässiga toxicitet (larvmotilitet och tillväxt analys), post-developmental åldersassocierade toxicitet (förlamning analys), och neuron morfologiska defekter (commissure analys).
Protocol
Representative Results
Discussion
Här rapporterar vi metoder som kan användas för att analysera RAN peptid toxicitet modelleras i muskeln eller i nervceller i C. elegans. Medan neurodegenerativa proteiner har en ålder debut fenotyp hos mänskliga patienter, de kan också uppvisa utvecklingsmässigt toxicitet när överuttrycks i modellsystem. Överuttryck har betydande tolkningsbegränsningar, men det ger också en kraftfull utgångspunkt för genetiska eller farmakologiska skärmar som syftar till att identifiera gener eller läkemedel som …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
References
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders. Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).
- The Huntington’s Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington’s disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
- Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
- Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).
- Genetic Modifiers of Huntington’s Disease Consortium. Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington’s Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington’s Disease Onset. Cell. 178 (4), 887-900 (2019).
- Wright, G. E. B., et al. Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease. American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).
- Cleary, J. D., Ranum, L. P. Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease. Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).
- Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology. Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).
- Banez-Coronel, M., et al. RAN Translation in Huntington Disease. Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).
- Ash, P. E., et al. Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS. Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).
- Kramer, N. J., et al. CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity. Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Scientific Reports. 6, 20877 (2016).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
- Boeynaems, S., et al. Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics. Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).
- Lee, K. H., et al. C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles. Cell. 167 (3), 717-788 (2016).
- Hao, Z., et al. Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR. Nature Communications. 10 (1), 2906 (2019).
- Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences. BMC Biotechnology. 11, 87 (2011).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).
- Rudich, P., et al. Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans. Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).
- Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), 1000399 (2009).
- Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).
- Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).
- Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans. PLoS One. 7 (3), 33494 (2012).
- Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
- Peters, O. M., et al. Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice. Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).
- O’Rourke, J. G., et al. C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD. Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).
- Mizielinska, S., et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins. Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).
- Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
- Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
