Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans
Summary
Les produits translationnels non dépendants à l’ATG associés à répétition sont des caractéristiques pathogènes émergentes de plusieurs maladies à base d’expansion répétée. Le but du protocole décrit est d’évaluer la toxicité causée par ces peptides à l’aide d’essais comportementaux et cellulaires dans le système modèle C. elegans.
Abstract
C. elegans est couramment utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives liées à l’âge causées par des mutations d’expansion répétée, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Huntington. Récemment, l’ARN contenant l’expansion répétée s’est avéré être le substrat d’un nouveau type de traduction de protéine appelé traduction non-dépendante de l’AUG (RAN) associée à la répétition. Contrairement à la traduction canonique, la traduction RAN ne nécessite pas de codon de démarrage et ne se produit que lorsque les répétitions dépassent une longueur de seuil. Parce qu’il n’y a pas de codon de démarrage pour déterminer le cadre de lecture, la traduction RAN se produit dans toutes les images de lecture à partir de modèles d’ARN de sens et d’antisense qui contiennent une séquence d’expansion répétée. Par conséquent, la traduction DE RAN augmente le nombre possible de peptides toxiques associés à la maladie possible de un à six. Jusqu’à présent, la traduction RAN a été documentée dans huit différentes maladies neurodégénératives et neuromusculaires basées sur l’expansion récidiviste. Dans chaque cas, le déchiffrement des produits RAN qui sont toxiques, ainsi que leurs mécanismes de toxicité, est une étape critique vers la compréhension de la façon dont ces peptides contribuent à la pathophysiologie de la maladie. Dans cet article, nous présentons des stratégies pour mesurer la toxicité des peptides RAN dans le système modèle C. elegans. Tout d’abord, nous décrivons les procédures pour mesurer la toxicité du peptide RAN sur la croissance et la motilité du développement de C. elegans. Deuxièmement, nous détaillons un essai pour mesurer les effets postdéveloppementaux et dépendants de l’âge des peptides RAN sur la motilité. Enfin, nous décrivons un essai de neurotoxicité pour évaluer les effets des peptides RAN sur la morphologie des neurones. Ces essais fournissent une évaluation large de la toxicité du peptide RAN et peuvent être utiles pour effectuer des écrans génétiques ou à petites molécules à grande échelle pour identifier les mécanismes ou les thérapies de la maladie.
Introduction
L’expansion inappropriée des séquences répétées d’ADN est la base génétique de plusieurs maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTD) et la maladie de Huntington (HD)1. Bien qu’il existe des modèles cellulaires et animaux établis pour ces maladies, les mécanismes sous-jacents à ces conditions ne sont pas bien définis. Par exemple, la MH est causée par l’expansion d’une séquence de répétition CAG dans la séquence de codage pour la protéine Huntingtin Htt2. Puisque CAG code la glutamine d’acide aminé, l’expansion de répétition de CAG a comme conséquence l’insertion d’une séquence de polyglutamine, ou polyQ, dans Htt. Les protéines polyQ élargies forment des agrégats de protéine de longueur et d’âge-dépendants qui sont associés à la toxicité3,4. Étonnamment, deux études récentes suggèrent que la longueur de la séquence de polyQ n’est pas le principal moteur de l’apparition de la maladie MH, suggérant que des facteurs polyQ-indépendants peuvent également contribuer à la maladie5,6.
Un mécanisme possible polyQ-indépendant implique un type nouvellement découvert de traduction de protéine appelée Repeat Associated Non-AUG-dependent (RAN) traduction7. Comme son nom l’indique, la traduction RAN ne se produit que lorsqu’une séquence de répétition élargie est présente et ne nécessite pas de codon de démarrage canonique. Par conséquent, la traduction RAN se produit dans les trois cadres de lecture de la répétition pour produire trois polypeptides distincts. En outre, parce que de nombreux gènes produisent également une transcription antisense qui contient le complément inverse de la séquence de répétition élargie, la traduction RAN se produit également dans les trois cadres de lecture de la transcription antisense. Ensemble, la traduction DE RAN augmente le nombre de protéines produites à partir d’une séquence d’ADN répétée élargie d’un peptide à six peptides. À ce jour, la traduction RAN a été observée dans au moins huit différents troubles d’expansion de répétition8. Peptides RAN sont observés dans les échantillons post mortem patient et seulement dans les cas où le patient porte une répétition élargie9,10. Tandis que ces peptides sont clairement présents dans les cellules patientes, leur contribution à la pathophysiologie de maladie n’est pas claire.
Pour mieux définir la toxicité potentielle associée aux peptides RAN, plusieurs groupes ont exprimé chaque peptide dans divers systèmes modèles, tels que la levure, les mouches, les souris et les cellules de culture tissulaire11,12,13,14,15,16. Plutôt que d’utiliser la séquence de répétition pour l’expression, ces modèles utilisent une approche de codon-variation dans laquelle la séquence de répétition est éliminée mais la séquence d’acide aminé est préservée. L’initiation de traduction se produit par un ATG canonique et le peptide est généralement fusionné à une protéine fluorescente au N- ou C-terminus, aucun de qui ne semble interférer avec la toxicité du peptide RAN. Par conséquent, chaque construction surexprime un seul peptide RAN. Modéliser les différents produits RAN dans un organisme multicellulaire avec des essais simples pour mesurer la toxicité du peptide RAN est d’une importance vitale pour comprendre comment les différents produits RAN de chaque expansion récidivante causant la maladie contribuent au dysfonctionnement cellulaire et à la neurodégénérescence.
Comme d’autres systèmes modèles, C. elegans fournit une plate-forme expérimentale flexible et efficace qui permet des études de nouveaux mécanismes de maladie, tels que la toxicité du peptide RAN. Les vers offrent plusieurs attributs expérimentaux uniques qui ne sont pas actuellement disponibles dans d’autres modèles de toxicité du peptide RAN. Tout d’abord, C. elegans sont optiquement transparents de la naissance jusqu’à la mort. Cela permet une visualisation simple de l’expression et de la localisation du peptide RAN, ainsi que l’analyse in vivo de la neurodégénérescence chez les animaux vivants. Deuxièmement, les méthodes transgéniques pour générer des modèles d’expression peptide RAN sont peu coûteuses et rapides. Étant donné le cycle de vie court de trois jours de C. elegans, les lignes transgéniques stables exprimant n’importe quel peptide RAN donné d’une manière spécifique de type cellulaire peuvent être produites en moins d’une semaine. Troisièmement, de simples sorties phénotypiques peuvent être combinées avec des méthodes de dépistage génétique, telles que la mutanèse chimique ou le dépistage de l’ARNi, afin d’identifier rapidement les gènes essentiels à la toxicité du peptide RAN. Enfin, la courte durée de vie de C. elegans (20 jours) permet aux chercheurs de déterminer comment le vieillissement, qui est le plus grand facteur de risque pour la plupart des maladies d’expansion répétée, influence la toxicité du peptide RAN. Ensemble, cette combinaison d’attributs expérimentaux est inégalée dans tout autre système modèle et offre une plate-forme puissante pour l’étude de la toxicité du peptide RAN.
Ici, nous décrivons plusieurs essais qui tirent parti des avantages expérimentaux de C. elegans pour mesurer la toxicité des peptides RAN et pour identifier les modificateurs génétiques de cette toxicité. Les peptides RAN codon-variés ATG-initiés sont marqués avec GFP et exprimés individuellement dans les cellules musculaires sous le promoteur de myo-3 ou dans les neurones moteurs GABAergic sous le promoteur unc-47. Pour l’expression dans les cellules musculaires, il est important que les peptides RAN toxiques soient étiquetés avec des protéines fluorescentes vertes (GFP), ou d’autres protéines fluorescentes (FP) qui peuvent être ciblées avec un vecteur d’alimentation RNAi. C’est parce que l’expression toxique de peptide de RAN bloque habituellement la croissance, rendant de telles souches non viables. L’utilisation de gfp (RNAi) inactive sous condition l’expression du peptide RAN et permet l’entretien des souches, les croix génétiques, etc. Pour les essais, ces animaux sont retirés de gfp (RNAi), ce qui permet l’expression du peptide RAN et des phénotypes qui en résultent. En plus de la stratégie moléculaire pour concevoir des constructions d’expression peptide RAN codon-variées, nous décrivons des essais pour mesurer la toxicité développementale (motilité larvaire et analyse de croissance), toxicité post-développementale associée à l’âge (analyse de paralysie), et défauts morphologiques neuronaux (essai de commissure).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous rapportons des méthodes qui peuvent être utilisées pour assayer la toxicité du peptide RAN modélisé dans le muscle ou dans les neurones de C. elegans. Tandis que les protéines neurodégénératives ont un phénotype d’âge de début dans les patients humains, elles peuvent également montrer la toxicité développementnelle une fois surexprimées dans des systèmes modèles. La surexpression a des limitations d’interprétation importantes, mais elle fournit également un point de départ pui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R21NS107797
Materials
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile | CELLTREAT Scientific Products | 50-202-036 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAR GRANULATED 2KILOGRAM | BD DIAGNOSTIC SYSTEMS | DF0145070 | Nematode growth plates and RNAi |
| AGAROSE ULTRAPURE | LIFE TECHNOLOGIES | 16500500 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| CARBENICILLIN 5G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP26485 | Nematode growth plates and RNAi |
| COVER GLASSES NO 1 22MM 1OZ/PK | THERMO SCI ERIE | 12542B | Imaging for commissure assay |
| FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242952008 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK | THERMO SCI ERIE | 125485C | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | THERMO SCI ERIE | 12-550-15 | Imaging for commissure assay |
| Gibco Bacto Peptone | Gibco | DF0118-17-0 | Nematode growth plates and RNAi |
| HALOCARBON OIL 700 | SIGMA-ALDRICH INC | H8898-50ML | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
| IPTG BIOTECH 10G | THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS | BP162010 | Nematode growth plates and RNAi |
| Leica Advanced Fluorescence imaging software | Leica Microsystems | LAS-AF | Image acquisition software for video speed analysis and commissure assay |
| Leica Immersion type N (Oil) | W NUHSBAUM INC | NC9547002 | Imaging for commissure assay |
| LEVAMISOLE HYDROCHLORIDE 10GR | THERMO SCI ACROS ORGANICS | AC187870100 | Imaging for commissure assay |
| MICROLOADER TIPS 2 X 96 PCS | EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS | E5242956003 | Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains |
PETRI DISH, 60X15MM,500/CS |
CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC | FB0875713A | Nematode growth plates and RNAi |
| TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS | CORNING LIFE SCIENCES DL | 87721 | Nematode growth plates and RNAi |
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