काइनेटिक क्रॉस-लिंकिंग और सीडीएनए का विश्लेषण एक ऐसी विधि है जो उच्च अस्थायी संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन की गतिशीलता की जांच की अनुमति देती है। यहां प्रोटोकॉल को विस्तार से वर्णित किया गया है, जिसमें खमीर कोशिकाओं की वृद्धि, यूवी क्रॉस-लिंकिंग, कटाई, प्रोटीन शुद्धिकरण और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी चरण शामिल हैं।
आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) और उनके आरएनए सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत तरलता और जटिलता प्रदर्शित करती है। अपने जीवनकाल के भीतर, एक एकल आरएनए को कई अलग-अलग आरबीपी से बांधा जा सकता है जो इसके उत्पादन, स्थिरता, गतिविधि और गिरावट को नियंत्रित करेगा। इस प्रकार, इन दो प्रकार के अणुओं के बीच मौजूद गतिशीलता को समझने के लिए बहुत कुछ किया गया है। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण सफलता ‘सी रॉस-एलइंकिंग और आईएममुनोपीरेसिपिटेशन’ (सीएलआईपी) के उद्भव के साथ आई। इस तकनीक ने कठोर जांच की अनुमति दी जिसमें आरएनए एक विशेष आरबीपी से बंधे हैं। संक्षेप में, रुचि का प्रोटीन यूवी को विवो में अपने आरएनए सब्सट्रेट्स से क्रॉस-लिंक किया जाता है, अत्यधिक कठोर परिस्थितियों में शुद्ध किया जाता है, और फिर प्रोटीन से सहसंयोजक रूप से क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है। इसकी अवधारणा के बाद से, सीएलआईपी को अध्ययन के विशेष क्षेत्रों के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए कई व्युत्पन्न तकनीकों को विकसित किया गया है। हालांकि, पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करके क्रॉस-लिंकिंग कुख्यात रूप से अक्षम है। इसके परिणामस्वरूप विस्तारित एक्सपोजर समय होता है जो आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के अस्थायी अध्ययन को असंभव बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में बहुत बेहतर यूवी विकिरण और सेल कटाई उपकरणों को डिजाइन और बनाया है। इन नए उपकरणों का उपयोग करते हुए, हमने उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर जीवित कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के समय-समाधान विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया: काइनेटिक सीआरऑस-लिंकिंग और सीडीएनए का एकनैलिसिस (3सीआरसी)। हमने हाल ही में पोषक तत्व तनाव अनुकूलन में खमीर आरबीपी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया। यह पांडुलिपि 34सी विधि का विस्तृत अवलोकन प्रदान करती है और एनआरडी 1 आरबीपी के साथ प्राप्त हाल के परिणामों को प्रस्तुत करती है।
आरएनए अक्सर अपने कार्य को बढ़ाने के लिए आरबीपी पर भरोसा करते हैं, जिससे इन अणुओं के बीच गतिशीलता को समझने में बहुत रुचि पैदा हुई है। कई आरबीपी की पहचान विभिन्न प्रकार के जीवों में की गई है। हालांकि, विवो में आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन का अध्ययन करना हमेशा मुश्किल रहा है। इस तरह की बातचीत का अध्ययन करने में एक बड़ी सफलता CLIP1 के उद्भव के साथ आई। यह विधि आरबीपी और उनके सीधे बंधे आरएनए (यानी, शून्य-दूरी क्रॉस-लिंकिंग) के बीच सहसंयोजक बंधन को प्रेरित करने के लिए पराबैंगनी (यूवी, 254 एनएम) विकिरण का उपयोग करती है। इसके बाद, रुचि के आरबीपी को कड़ी शर्तों के तहत इम्यूनोप्यूरिफाइड किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रोटीन से जुड़े केवल आरएनए की पहचान की जाती है। बाध्य आरएनए को तब आंशिक रूप से आरएनएस के साथ पचाया जाता है और बाद में अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जाता है। उच्च शुद्धि स्ट्रिंगेंसी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह प्रोटीन और आरएनए रिकवरी की विशिष्टता को बहुत बढ़ाता है, जिसे क्रॉस-लिंक्ड राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) कॉम्प्लेक्स के एसडीएस-पेज शुद्धिकरण के माध्यम से भी बढ़ाया जाता है। क्लिप और संबंधित विधियां प्रोटीन बाइंडिंग साइट में न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन अंतर्दृष्टि भी प्रदान करती हैं, क्योंकि अनुक्रमण लाइब्रेरी की तैयारी के दौरान, आरएनए से क्रॉस-लिंक्ड अमीनो एसिड अक्सर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस को समाप्त करते हैं या एंजाइम को इस साइट 1,2,3 पर उत्परिवर्तन पेश करने का कारण बनते हैं।
इसकी शुरूआत के बाद से, मूल CLIP प्रोटोकॉल ने व्युत्पन्न पद्धतियों की एक उल्लेखनीय विविधता का उत्पादन किया है। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण सफलता HITS-CLIP (या CLIP-seq) के विकास के साथ आई, जो CLIP दृष्टिकोण3 के साथ उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का विलय करता है। यह तब से सभी CLIP-आधारित पद्धतियों द्वारा अपनाया गया है। iCLIP ने RNase-मध्यस्थता ट्रिमिंग और एडाप्टर लिगेशन तकनीकों में सुधार पेश किया जो RBP बाइंडिंग साइटों के अधिक सटीक मानचित्रण की सुविधा प्रदान करतेहैं। PAR-CLIP ने 365 nm पर क्रॉस-लिंकिंग के साथ 4thio-uridine/Uracil लेबलिंग को जोड़ा, जिससे T-C प्रतिस्थापन 5 का विश्लेषण करके क्रॉस-लिंकिंग साइटों को मैप करना संभव होगया। सीआरएसी, यूरिया-आईसीएलआईपी, डीसीएलआईपी और यूवीसीएलएपी ने विकृत स्थितियों और दोहरे आत्मीयता शुद्धिकरण चरणों की शुरुआत की जो आत्मीयता राल के लिए पृष्ठभूमि बंधन को कम करते हैं और प्रोटीन कैप्चर 2,6,7,8,9 की विशिष्टता को और बढ़ाते हैं। इसके अतिरिक्त, सीआरएसी, यूवीसीएलएपी और डीसीएलआईपी ने रुचि के आरबीपी को आत्मीयता टैग के साथ टैग करना शुरू किया, इस प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी उत्पन्न करने की आवश्यकता पर काबू पाया।
CLIP पद्धति में तेजी लाने के लिए कई अनुकूलन भी किए गए हैं। मूल क्लिप प्रोटोकॉल ने एसडीएस-पेज के बाद आरबीपी-आरएनए कॉम्प्लेक्स की कल्पना करने के लिए कैप्चर किए गए आरएनए के रेडियोलेबलिंग का उपयोग किया। हालांकि, रेडियोधर्मिता का उपयोग उन प्रयोगशालाओं के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जो इस तरह के काम के लिए स्थापित नहीं हैं। आईआरसीएलआईपी में एक फ्लोरोफोरे-युग्मित एडाप्टर शामिल है जो इन्फ्रारेड इमेजिंग10 के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा प्रदान करता है और एससीलिप कैप्चर किए गए आरएनए के बायोटिनाइलेशन का उपयोग करता है ताकि उन्हें स्ट्रेप्टाविडिन-संयुग्मित एचआरपी11 के माध्यम से कल्पना की जा सके। इसके अलावा, ईसीएलआईपी पूरी तरह से आरएनए लेबलिंग को छोड़ देता है; इसके बजाय प्रोटीन को केवल इसके ज्ञात आकार12 के आधार पर उत्पादित किया जाता है। स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित शुद्धिकरण का उपयोग फास्ट-आईसीएलआईपी में पुस्तकालय तैयार करने की प्रक्रिया को तेज करने के लिए भी किया गया है, जहां आरएनए पर एक बायोटिनाइलेटेड 3 ‘एडाप्टर लगाया जाता है और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और सर्कुलराइजेशन13 के बाद शुद्धिकरण को सक्षम करने के लिए उपयोग किया जाता है। आईसीएलआईपी प्रोटोकॉल में अतिरिक्त वृद्धिने पुस्तकालयों की जटिलता को भी बहुत बढ़ा दिया।
अंत में, क्लिप को विभिन्न सेलुलर उपकम्पार्टमेंट14,15 से आरबीपी को कैप्चर करने में सक्षम बनाने के लिए संशोधित किया गया है, फोटोएक्टिवेबल राइबोन्यूक्लिओसाइड्स 5,16,17 के स्पंदित प्रेरण का उपयोग करके नए स्थानांतरित आरएनए की कल्पना करने के लिए, मिथाइलेटेड आरएनए 18,19,20 को पकड़ने के लिए, आरएनए-आरएनए इंटरैक्शन 21,22 की जांच करने के लिए, और 3 ‘ सिरों 23,24 को मैप करने के लिए।.
आरबीपी और आरएनए के बीच बातचीत की हमारी समझ में सहायता करने में क्लिप-आधारित तकनीकों के महान योगदान के बावजूद, यह यूवी क्रॉस-लिंकिंग की अक्षमता से सीमित हो गया है। यद्यपि एक मोनोलेयर में उगाई गई संस्कृति कोशिकाएं आम तौर पर क्रॉस-लिंक करने के लिए अपेक्षाकृत आसान होती हैं, यह समाधान में ऊतकों या कोशिकाओं में काफी अधिक चुनौतीपूर्ण है। ऊतकों को आवश्यक सेल परतों में प्रवेश करने के लिए यूवी एक्सपोजर के कई राउंड की आवश्यकता हो सकती है, जबकि माइक्रोबियल कोशिकाओं को अक्सर समृद्ध माध्यमों में उगाया जाता है जिसमें सुगंधित, यूवी-अवशोषितयौगिक होते हैं। दरअसल, 30 मिनट तक के यूवी विकिरण समय का उपयोग ऐसे नमूनों26,27,28 के लिए आरबीपी और उनके बाध्य आरएनए के बीच पर्याप्त क्रॉस-लिंकिंग उत्पन्न करने के लिए किया गया है। यह विस्तारित यूवी एक्सपोजर सेल के भीतर तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है, जैसे यूवी-प्रेरित डीएनए क्षति, जो कुछ अनुप्रयोगों में अंतिम डेटा को दूषित कर सकती है।
अधिकांश CLIP अध्ययनों ने एक सेल में विशिष्ट प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन के एकल “स्नैपशॉट” उत्पन्न करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन स्वाभाविक रूप से गतिशील होते हैं, खासकर जब कोशिकाएं अपने पर्यावरण में परिवर्तन के अधीन होती हैं। इसमें आवश्यक पोषक तत्वों की उपलब्धता में अचानक कमी या तापमान में तेजी से बदलाव शामिल हो सकते हैं। जैसे, तनाव के दौरान आरबीपी की भूमिका को वास्तव में समझने के लिए, समय-समाधान विश्लेषण करना सबसे अच्छा है क्योंकि वे तनाव के दौरान आरबीपी लक्ष्यों के पूर्ण स्पेक्ट्रम को पकड़ सकते हैं और यह निर्धारित कर सकते हैं कि तनाव प्रतिक्रिया के किस चरण में चुना गया आरबीपी सक्रिय है। विशेष रूप से, खमीर में अध्ययन से पता चला है कि अनुकूलन के पहले कुछ मिनट जीवित रहने के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण हैं और बैक्टीरिया में आरएनए अर्ध-जीवन मिनट से सेकंड 29,30,31,32,33 तक भिन्न हो सकता है। इसलिए, इस तरह के समय-हल किए गए विश्लेषण आदर्श रूप से उच्च अस्थायी संकल्प पर किए जाने चाहिए। हालांकि, लंबे समय तक क्रॉस-लिंकिंग समय प्रारंभिक चरण अनुकूली प्रतिक्रियाओं के अध्ययन को विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनाते हैं।
इन मुद्दों को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में एक बेहतर विधि विकसित की है जो मिनट-लंबे टाइमस्केल पर कोशिकाओं को क्रॉस-लिंक करने और कटाई करने में सक्षम है। हमारी 3सीआरसी विधि पहले से ही अस्पष्ट संकल्प पर आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन में गतिशील परिवर्तनों के मात्रात्मक माप की अनुमति देती है। इस विधि के लिए महत्वपूर्ण एक नए यूवी विकिरण उपकरण32 का विकास था जो समाधान में खमीर और बैक्टीरिया में आवश्यक क्रॉस-लिंकिंग समय को लगभग 10 गुना कम करता है, प्रभावी रूप से आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन को तुरंत फ्रीज करता है। इसके अलावा, यूवी विकिरण के बाद कोशिकाओं को तेजी से काटने के लिए, हमने एक वैक्यूम निस्पंदन उपकरण विकसित किया जो लगभग 30 एस32 में 0.5 एल संस्कृति में तेजी से बढ़ते खमीर की कटाई कर सकता है। ये तकनीकी नवाचार मिनट-स्केल रिज़ॉल्यूशन पर आरबीपी-आरएनए गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, हमने इसकी व्यावहारिकता बढ़ाने के लिए मूल सीआरएसी प्रोटोकॉल2 में कई अनुकूलन भी पेश किए।
3सीआरसी का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में ग्लूकोज की कमी के जवाब में एक खमीर परमाणु आरबीपी, एनएबी 3 के लक्ष्य का अध्ययन किया। सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में, एनएबी 3 एनएनएस कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए एनआरडी 1, एक आरबीपी और आरएनए हेलिकेस सेन 1 के साथ एक कॉम्प्लेक्स बना सकता है। आरएनए पोलीमरेज़ और नवजात प्रतिलेख के लिए एनएनएस बाइंडिंग ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेशन34 को ट्रिगर कर सकती है। यह कॉम्प्लेक्स ज्यादातर क्रिप्टिक नॉनकोडिंग आरएनए ट्रांस्क्रिप्ट को हटाने में शामिल है, लेकिन प्रोटीन-कोडिंग जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए भी दिखाया गया है। अध्ययन में केवल एक मिनट के तनाव32 के बाद नॉनकोडिंग और कोडिंग टेप के लिए एनएबी 3 के अंतर लक्ष्यीकरण को दिखाया गया। हमने दिखाया कि एनएबी 3 द्वारा सह-ट्रांसक्रिप्शनल समाप्ति के परिणामस्वरूप रेट्रोट्रांसपोसन जीन की एक बहुत ही क्षणिक, पल्स जैसी अभिव्यक्ति होती है, जिसे पारंपरिक क्लिप-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके पता लगाना मुश्किल होता। इसके अतिरिक्त, हमारे यूवी क्रॉस-लिंकर में छोटे यूवी विकिरण समय ने अल्पकालिक नॉनकोडिंग आरएनए32 की वसूली में भी काफी वृद्धि की। CRAC संभवतः यह स्पष्ट करने में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा कि आरबीपी तत्काल टाइमस्केल पर तनाव की प्रतिक्रिया को कैसे आकार देते हैं, बल्कि प्रतिक्रिया के पूरे जीवनचक्र के दौरान उनकी बदलती भूमिकाएं भी हैं। यह पांडुलिपि 3सीआरसी प्रोटोकॉल में सभी चरणों का विस्तृत अवलोकन प्रदान करती है। उदाहरण के लिए, विधि का उपयोग खमीर एनआरडी 1 प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए किया गया था, जो ट्रांसक्रिप्शनल समाप्ति और आरएनए क्षय35,36 में शामिल है, और इसके आरएनए टारगेटोम ने कई टाइमपॉइंट्स में ग्लूकोज की कमी के जवाब में। अंत में, हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि हमारी यूवी विकिरण इकाई तेजी से आरबीपी को हेला कोशिकाओं में आरएनए से क्रॉस-लिंक कर सकती है, जिससे अनुयायी कोशिकाओं में उच्च-रिज़ॉल्यूशन समय-समाधान विश्लेषण करना भी संभव हो जाता है।
नए क्रॉस-लिंकिंग और सेल हार्वेस्टिंग उपकरणों के साथ संयुक्त 3सीआरसी विधि में बड़ी क्षमता है क्योंकि यह मॉडल जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है और इसलिए आरएनए क्षेत्र के लिए सामान्य रुचि होनी चाहिए। ऐसे कई क्षेत्र हैं जिनमें 3CC का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विधि का उपयोग प्रोटीन की पदानुक्रमित असेंबली को बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स में मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि स्प्लिसोसोम और राइबोसोम, जिसमें अक्सर प्रोटीन और आरएनए अणुओं के बीच गतिशील बातचीत शामिल होती है। अब हम नियमित रूप से आरएनए क्षय कारकों और उनके सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत की निगरानी के लिए इसका उपयोग करते हैं जब कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के तनावों के अधीन होती हैं। यह हमें यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि अनुकूली प्रतिक्रिया के किस चरण में ये कारक सबसे सक्रिय हैं, वे किस सब्सट्रेट से बंधते हैं, और ये इंटरैक्शन कितने गतिशील हैं। इस तरह के डेटा को शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूलन में प्रत्येक कारक के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने में सक्षम बनाना चाहिए।
अत्यधिक कठोर और विकृत परिस्थितियों में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए 3सीआरसी दोहरे आत्मीयता शुद्धिकरण टैग (एचटीएफ या एचटीपी) का उपयोग करता है। यह सुनिश्चित करता है कि कोप्यूरिफाइड आरएनए आरएनए के लिए अत्यधिक समृद्ध है जो सहसंयोजक रूप से रुचि के प्रोटीन से जुड़े थे। हालांकि, आत्मीयता टैग पर भरोसा करने के नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, टैग प्रोटीन फ़ंक्शन में हस्तक्षेप कर सकता है, जो इसके आरएनए-बाइंडिंग इंटरएक्टोम का विकृत रीडआउट दे सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ मॉडल जीवों के लिए टैग का उपयोग करना हमेशा संभव नहीं हो सकता है क्योंकि जीनोम में डीएनए टुकड़ों को एकीकृत करने या अभिव्यक्ति प्लास्मिड को बदलने के लिए आनुवंशिक उपकरण अभी तक उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, आरबीपी के शुद्धिकरण के लिए एंटीबॉडी पर भरोसा करने वाले क्लिप-आधारित प्रोटोकॉल के साथ संगत बनाने के लिए 3सीआरसी प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को बदलना आसान है। दरअसल, इस अध्ययन से पता चला है कि हमारे क्रॉसलिंकर के साथ आईसीएलआईपी-आधारित शुद्धिकरण को जोड़ना संभव है। अब हम नवजात आरएनए प्रतिलेख के साथ मानव आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के अस्थायी संबंध का अध्ययन करने के लिए क्लिप प्रोटोकॉल विकसित करने की प्रक्रिया में हैं।
एक नए प्रोटीन पर 3सीआरसी का प्रदर्शन करते समय, अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग को प्रेरित करने के लिए यूवी एक्सपोजर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च यूवी एक्सपोजर शुद्धिकरण चरण के दौरान आरएनए की वसूली को कम कर सकते हैं। पुनः संयोजक आरबीपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को विभिन्न यूवी खुराक, 100 एमजे / सेमी2, 250 एमजे / सेमी2, 500 एमजे / सेमी2, और 1 जे / सेमी2 के संपर्क में लाया गया था। आरएनपी पर कब्जा कर लिया गया और आरएनए को खंडित और रेडियोलेबल किया गया। बाद में, आरएनपी को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया था और यह पता लगाने के लिए एक ऑटोरेडियोग्राम लिया गया था कि कौन सा एक्सपोजर सबसे तीव्र संकेत देता है (यानी अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग)।
एक बार प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के बाद, कई नियंत्रण प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, शुद्धि करण मोतियों के लिए पृष्ठभूमि बंधन की निगरानी के लिए एक यूवी विकिरणित, अनटैग्ड नमूने का उपयोग किया जा सकता है। दूसरा, एक शिफ्ट प्रयोग के दौरान 3सीआरसी लागू करते समय, दूसरी बार की श्रृंखला जहां कोशिकाओं को मूल माध्यम में वापस स्थानांतरित किया जाता है, जांच को सक्षम बनाता है कि क्या कोशिकाओं का निस्पंदन स्वयं आरएनए स्तर या प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन में परिवर्तन लाता है।
जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, हाल ही में प्रकाशित कई पेपर क्लिप प्रोटोकॉल के लिए कई अनुकूलन का सुझाव देते हैं। इसमें इन्फ्रारेड स्कैनिंग10 के माध्यम से प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एडाप्टर का उपयोग शामिल है और साथ ही परिणामस्वरूप पुस्तकालयोंकी जटिलता को बढ़ाने के लिए दिखाए गए विभिन्न न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण और आकार चयन चरणों के अनुकूलन शामिल हैं। हम वर्तमान में इनमें से कुछ सुधारों को लागू कर रहे हैं ताकि 3सीआरसी प्रोटोकॉल को और परिष्कृत किया जा सके। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में पहले से ही मूल सीआरएसी और एसीआरसी प्रोटोकॉल में कई सुधार शामिल हैं जो डेटा की जटिलता को बढ़ाते हैं। उदाहरण के लिए, पहले, एसडीएस-पेज जैल पर क्रॉस-लिंक्ड, रेडियोधर्मी प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स को हल करने के बाद, उन्हें नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था और क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को धब्बा से अलग किया गया था। हालांकि, आरएनपी और बाद में आरएनए निष्कर्षण का हस्तांतरण बहुत अक्षम हो सकता है, खासकर जब आरएनए पोलीमरेज़ सबयूनिट्स जैसे बड़े आरबीपी से निपटते हैं। इसके परिणामस्वरूप क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में महत्वपूर्ण कमी हो सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीधे एसडीएस-पेज जेल स्लाइस से निकाला जाता है जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इससे क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, सीडीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के बाद उत्पाद को मूल रूप से 3%, कम पिघलने वाले तापमान अगारोस जैल पर हल किया गया था, और फिर जेल से 175-300 बीपी पीसीआर उत्पादों को निकाला गया था। हालांकि, इन जैल को आसानी से ओवरलोड किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए का बहुत खराब पृथक्करण होता है। प्रीकास्ट टीबीई जैल के साथ अगारोस जैल को बदलने के परिणामस्वरूप अधिक सुसंगत आकार पृथक्करण और पीसीआर उत्पादों की बेहतर वसूली हुई।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को वेलकम ट्रस्ट (एसजी को 091549 और 109093/जेड/15/ए से एसएम), वेलकम ट्रस्ट सेंटर फॉर सेल बायोलॉजी कोर ग्रांट (092076) और मेडिकल रिसर्च काउंसिल नॉन-क्लिनिकल सीनियर रिसर्च फैलोशिप (एमआर/आर008205/1 से एसजी), यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान संगठन से दीर्घकालिक पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (एएलटीएफ 1070-2017 से आर.ए.सी.) के तहत अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। और स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (टी.एच.जे.)।
1,4-dithioreitol | Merck | 10708984001 | Buffer component in mammalian cell lysis |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | General reaction tube |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | For holding columns and collection of waste |
32P-yATP | Perkin Elmer | NEG502Z-250 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
4-12% Bis-Tris gel | Invitrogen | NP0321BOX | SDS-PAGE gel |
4X loading buffer | Novex | NP0008 | Protein loading dye concentrate |
50 bp ladder | New England Biolabs | N3236 | Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library |
50% PEG | NEB | B100045 | For the L5 linker ligation |
6% TBE gel | Invitrogen | EC6265BOX | For separation and purification of the cDNA library |
Acetone | ACROS Organics | 423245000 | Washing of TCA-precipitated proteins |
anti-FLAG beads | Sigma Aldrich | M8823-1ML | For purifcation of FLAG-tagged RBPs |
ATP (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0441 | For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs |
Beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | Buffer component |
Biomax MS intensifying screen | Sigma Aldrich | Z363162-1EA | For intensifying the autoradiogram signal |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | 1010219 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | For inhibition of cellular proteases after lysis |
Complete supplement mixture -TRP | Formedium | DCS0149 | For preparation of synthetic defined medium |
Costar Spin-X 0.22 µm filters | Sigma Aldrich | CLS8160 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
DNase RQ1 | Promega | M6101 | For DNA digest following cell lysis |
dNTPs (10 mM) | Sigma Aldrich | 4638956001 | For reverse transcription and PCR |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10041814 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen | AM9261 | For protease K buffer |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293 | For degradation of primers following PCR |
Glass microfiber filters | Whatman | 1823-010 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
Glucose | Formedium | GLU03 | For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium |
Glycogen (20 mg/mL) | Roche | 10901393001 | Precipitation of proteins, RNA and DNA |
GST-TEV | Homemade | Construct and purification protocol is available upon request | |
Guanidium hydrochloroide | Thermo Fisher Scientific | 10071503 | Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer |
IgG beads | GE Healthcare | 17-0969-01 | For purification of protein A-tagged RBPs |
Imidazole | Sigma Aldrich | I2399-100G | For elution of captured proteins from Nickel beads |
Isoamyl alcohol | Thermo Fisher Scientific | A393-500 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Luna Universal One-Step RT-qPCR | NEB | E3005S | For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles |
Magnesium chloride | Fluka Analytical | 63020-1L | For PNK buffer |
Membrane filters | Millipore | AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria | For vacuum filtration of cells |
Micro bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | For collecting eluate after gel extraction |
Ni-NTA beads | Qiagen | 30210 | For secondary protein capture |
NP-40 | Sigma Aldrich | I8896-100ML | Buffer component |
Pfu polymerase | Promega | M7741 | For amplification of the cDNA library |
Phenol | Sigma Aldrich | P4682-400ML | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Pierce spin columns | Thermo Fisher Scientific | 69725 | For on-column enzymatic reactions |
Protease K | Roche | 3115887001 | For degradation of the RBP following gel extraction |
Quartz Petri dish | UVO3 | N/A | For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP |
Radiography films | Amersham | 28906843 | For autoradiography visualisation |
RNAClean XP beads | Beckmann | A63987 | SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs |
RNase H | New England Biolabs | M0297 | For degradation of RNAs following reverse transcription |
RNase-It | Agilent | 400720 | For RNA digestion |
rRNasin | Promega | N2511 | For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889-1KG | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | Buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-100G | Buffer component in mammalian cell lysis |
Sodium dodecylsulfate | Sigma Aldrich | L3771-1KG | For protease K buffer |
SUPERase-In | Invitrogen | AM2694 | For inhibition of cellular RNases after lysis |
SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | For reverse transcription |
T4 PNK | New England Biolabs | M0201 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204 | For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end |
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q | NEB | M0351S | For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs |
TBE buffer (10X) | Invitrogen | 15581-028 | For running TBE gels |
TEV protease | Homemade | For eluting captured proteins following FLAG capture | |
Thermosensitive alkaline phosphatase | Promega | M9910 | For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs |
Trichloroacetic acid (100%) | Sigma Aldrich | T0699-100ML | For precipitation of RBP-RNA complexes |
Tris hydrochloride | Invitrogen | 15504-020 | Buffer component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Buffer component in mammalian cell lysis |
Vari Filter | UVO3 | N/A | Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP |
Vari-X-Linker | UVO3 | N/A | Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP |
Yeast nitrogen base | Formedium | CYN0410 | For preparation of synthetic defined medium |
Zirconia beads | Thistle | 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria | For cell lysis via bead beating |