Kinetisk tvärbindning och analys av cDNA är en metod som möjliggör undersökning av dynamiken i protein-RNA-interaktioner i levande celler vid hög tidsupplösning. Här beskrivs protokollet i detalj, inklusive tillväxt av jästceller, UV-tvärbindning, skörd, proteinrening och nästa generations sekvenseringsbiblioteksberedningssteg.
Samspelet mellan RNA-bindande proteiner (RBP) och deras RNA-substrat uppvisar fluiditet och komplexitet. Inom sin livslängd kan ett enda RNA bindas av många olika RBP som reglerar dess produktion, stabilitet, aktivitet och nedbrytning. Som sådan har mycket gjorts för att förstå dynamiken som finns mellan dessa två typer av molekyler. Ett särskilt viktigt genombrott kom med uppkomsten av “cross-l bläckning och immunoprecipitation” (CLIP). Denna teknik möjliggjorde strikt undersökning av vilka RNA som är bundna av en viss RBP. Kort sagt, proteinet av intresse är UV-tvärbundet till dess RNA-substrat in vivo, renat under mycket stränga förhållanden, och sedan omvandlas RNA: erna kovalent tvärbundna till proteinet till cDNA-bibliotek och sekvenseras. Sedan dess uppfattning har många derivattekniker utvecklats för att göra CLIP mottaglig för vissa studier. Tvärbindning med ultraviolett ljus är dock notoriskt ineffektivt. Detta resulterar i förlängda exponeringstider som gör den tidsmässiga studien av RBP-RNA-interaktioner omöjlig. För att lösa detta problem har vi nyligen designat och byggt mycket förbättrade UV-bestrålnings- och cellskördsenheter. Med hjälp av dessa nya verktyg utvecklade vi ett protokoll för tidsupplösta analyser av RBP-RNA-interaktioner i levande celler med hög tidsupplösning: Kinetic CRoss-linking och Analysis of cDNAs (χCRAC). Vi använde nyligen denna teknik för att studera rollen av jäst RBP i näringsstress anpassning. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över χCRAC-metoden och presenterar de senaste resultaten som erhållits med Nrd1 RBP.
RNA förlitar sig ofta på RBP för att utöva sin funktion, vilket har lett till stort intresse för att förstå dynamiken mellan dessa molekyler. Många RBP har identifierats i en mängd olika organismer. Det har dock alltid varit notoriskt svårt att studera RBP-RNA-interaktioner in vivo. Ett stort genombrott i att studera sådana interaktioner kom med uppkomsten av CLIP1. Denna metod använder ultraviolett (UV, 254 nm) bestrålning för att inducera kovalenta bindningar mellan RBP och deras direktbundna RNA (dvs nolldistanstvärbindning). Därefter immunrenas RBP under stränga förhållanden för att säkerställa att endast RNA kovalent tvärbundna till proteinerna identifieras. Bundna RNA smälts sedan delvis med RNaser och omvandlas därefter till cDNA-bibliotek för sekvensering. Den höga reningsstringensen är viktig eftersom den kraftigt ökar specificiteten av protein- och RNA-återhämtning, vilket också förbättras ytterligare genom SDS-PAGE-rening av det tvärbundna ribonukleoproteinkomplexet (RNP). CLIP och relaterade metoder ger också nukleotidupplösningsinsikt i proteinbindningsstället, eftersom aminosyror som tvärbundna till RNA under beredningen av sekvenseringsbiblioteket ofta avslutar det omvända transkriptaset eller får enzymet att införa mutationer på denna plats 1,2,3.
Sedan introduktionen har det ursprungliga CLIP-protokollet producerat en anmärkningsvärd mängd derivatmetoder. Ett särskilt viktigt genombrott kom med utvecklingen av HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som kombinerar sekvensering med hög genomströmning med CLIP-metoden3. Detta har sedan dess antagits av alla CLIP-baserade metoder. iCLIP introducerade förbättringar i RNase-medierade trimnings- och adapterligeringstekniker som underlättar mer exakt kartläggning av RBP-bindningsställena4. PAR-CLIP kombinerade 4tio-uridin/uracilmärkning med tvärbindning vid 365 nm, vilket gjorde det möjligt att kartlägga tvärbindningsplatser genom att analysera T-C-substitutioner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP och uvCLAP introducerade denatureringsförhållanden och reningssteg med dubbel affinitet som ytterligare minskar bakgrundsbindningen till affinitetshartset och ytterligare ökar specificiteten för proteininfångning 2,6,7,8,9. Dessutom introducerade CRAC, uvCLAP och dCLIP märkning av RBP av intresse med en affinitetstagg, vilket övervann behovet av att generera specifika antikroppar.
Flera optimeringar har också gjorts för att påskynda CLIP-metodiken. Det ursprungliga CLIP-protokollet använde radiomärkning av de fångade RNA: erna för att visualisera RBP-RNA-komplexen efter SDS-PAGE. Användningen av radioaktivitet kan dock vara problematisk för laboratorier som inte inrättats för sådant arbete. irCLIP innehåller en fluoroforkopplad adapter som underlättar visualisering genom infraröd avbildning10 och sCLIP använder biotinylering av fångade RNA för att visualisera dem genom streptavidin-konjugerad HRP11. Dessutom avstår eCLIP helt från RNA-märkning; Istället skärs proteinet enbart baserat på dess kända storlek12. Streptavidinbaserad rening har också använts för att påskynda processen för biblioteksberedning i FAST-iCLIP, där en biotinylerad 3′-adapter ligeras på RNA och används för att möjliggöra rening efter omvänd transkription och cirkularisering13. Ytterligare förbättringar av iCLIP-protokollet ökade också bibliotekens komplexitet kraftigt4.
Slutligen har CLIP modifierats för att möjliggöra infångning av RBP från olika cellulära underavdelningar 14,15, för att visualisera nyligen transkriberade RNA med pulsad induktion av fotoaktiverbara ribonukleosider 5,16,17, för att fånga metylerade RNA 18,19,20, för att undersöka RNA-RNA-interaktioner 21,22 och för att kartlägga 3′-ändar 23,24.
Trots de stora bidragen från CLIP-baserade tekniker för att hjälpa vår förståelse av interaktionerna mellan RBP och RNA, har det begränsats av ineffektiviteten hos UV-tvärbindning. Även om odlingsceller som odlas i ett monolager i allmänhet är relativt lätta att tvärbinda, är detta betydligt mer utmanande i vävnader eller celler i lösning. Vävnader kan kräva flera omgångar av UV-exponering för att tränga in i de nödvändiga cellskikten, medan mikrobiella celler ofta odlas i rika medier som innehåller aromatiska, UV-absorberande föreningar25. Faktum är att UV-bestrålningstider på upp till 30 minuter har använts för att generera tillräcklig tvärbindning mellan RBP och deras bundna RNA för sådana prover26,27,28. Denna utökade UV-exponering inducerar stressreaktioner i cellen, såsom UV-inducerad DNA-skada, som kan förorena slutdata i vissa applikationer.
Majoriteten av CLIP-studierna har fokuserat på att generera enstaka “ögonblicksbilder” av specifika protein-RNA-interaktioner i en cell. Protein-RNA-interaktioner är emellertid i sig dynamiska, särskilt när celler utsätts för förändringar i sin miljö. Detta kan inkludera en plötslig minskning av tillgången på viktiga näringsämnen eller snabba temperaturförändringar. Som sådan, för att verkligen förstå rollen som en RBP under stress, är det bäst att utföra tidsupplösta analyser eftersom de kan fånga hela spektrumet av RBP-mål under stress och bestämma i vilket skede av stressresponsen den valda RBP är aktiv. I synnerhet visade studier i jäst att de första minuterna av anpassning är helt avgörande för överlevnad och RNA-halveringstider i bakterier kan variera från minuter till sekunder 29,30,31,32,33. Därför bör sådana tidsupplösta analyser helst utföras med hög tidsupplösning. De långa tvärbindningstiderna gör dock studien av tidiga adaptiva svar särskilt utmanande.
För att övervinna dessa problem utvecklade vi nyligen en förbättrad metod som kan tvärbinda och skörda celler på minutlånga tidsskalor. Vår χCRAC-metod möjliggör kvantitativ mätning av dynamiska förändringar i RBP-RNA-interaktioner vid tidigare obevittnad upplösning. Avgörande för denna metod var utvecklingen av en ny UV-bestrålningsanordning32 som minskar den erforderliga tvärbindningstiden i jäst och bakterier i lösning runt 10-faldig, vilket effektivt fryser RBP-RNA-interaktioner omedelbart. Dessutom, för att snabbt skörda cellerna efter UV-bestrålning, utvecklade vi en vakuumfiltreringsanordning som kan skörda exponentiellt växande jäst i en 0,5 L kultur i cirka 30 s32. Dessa tekniska innovationer möjliggör studier av RBP-RNA-dynamik vid minutskala upplösning. Dessutom introducerade vi flera optimeringar av det ursprungliga CRAC-protokollet2 för att öka dess praktiska egenskaper.
Med hjälp av χCRAC studerade vi nyligen targetome av en jästkärnteknisk RBP, Nab3, som svar på glukosbrist. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 bilda ett komplex med Nrd1, en RBP och RNA-helikasen Sen1 för att bilda NNS-komplexet. NNS-bindning till RNA-polymeraset och det begynnande transkriptet kan utlösa transkriptionsavslutning34. Detta komplex är mestadels involverat i att ta bort kryptiska icke-kodande RNA-transkript men har också visat sig reglera uttryck av proteinkodande gener. Studien visade differentiell inriktning av Nab3 till icke-kodande och kodande transkript efter bara en minut av stress32. Vi visade att samtranskriptionell terminering av Nab3 resulterar i ett mycket övergående, pulsliknande uttryck av retrotransposongener, vilket skulle ha varit svårt att upptäcka med traditionella CLIP-baserade metoder. Dessutom ökade de korta UV-bestrålningstiderna i vår UV-tvärbindning också signifikant återhämtningen av kortlivade icke-kodande RNA32. χCRAC kommer sannolikt att vara ett viktigt verktyg för att belysa inte bara hur RBP formar svaret på stress på omedelbara tidsramar utan också deras förändrade roller under hela livscykeln för en respons. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över alla steg i χCRAC-protokollet. För illustrativa ändamål användes metoden för att studera jäst Nrd1-proteinet, som är involverat i transkriptionell terminering och RNA-sönderfall35,36, och dess RNA-målome som svar på glukosbrist över en mängd tidpunkter. Slutligen visar vi också att vår UV-bestrålningsenhet snabbt kan tvärbinda RBP till RNA i HeLa-celler, vilket gör det möjligt att även utföra högupplösta tidsupplösta analyser i vidhäftande celler.
χCRAC-metoden, i kombination med de nya tvärbindnings- och cellskördeanordningarna, har stor potential eftersom den är tillämplig på ett brett spektrum av modellorganismer och därför bör vara av allmänt intresse för RNA-fältet. Det finns många områden där χCRAC kan användas. Metoden skulle till exempel kunna användas för att mäta den hierarkiska sammansättningen av proteiner i stora makromolekylära komplex, såsom spliceosomen och ribosomen, vilket ofta involverar dynamiska interaktioner mellan proteiner och RNA-molekyler. Vi använder det nu också rutinmässigt för att övervaka interaktioner mellan RNA-sönderfallsfaktorer och deras substrat när celler utsätts för olika slags påfrestningar. Detta gör det möjligt för oss att bestämma i vilket skede av det adaptiva svaret dessa faktorer är mest aktiva, vilka substrat de binder till och hur dynamiska dessa interaktioner är. Sådana uppgifter bör göra det möjligt för forskare att avgöra varje faktors relativa bidrag till anpassningen till miljöförändringar.
χCRAC använder dubbla affinitetsreningstaggar (HTF eller HTP) för att rena proteinet under mycket stränga och denatureringsförhållanden. Detta säkerställer att det korenade RNA är mycket anrikat för RNA som kovalent korsbundet till proteinet av intresse. Att förlita sig på tillhörighetstaggar har dock nackdelar. Till exempel kan taggen störa proteinfunktionen, vilket kan ge en förvrängd avläsning av dess RNA-bindande interaktom. Dessutom kan det för vissa modellorganismer inte alltid vara möjligt att använda taggar eftersom de genetiska verktygen för att integrera DNA-fragment i genomet eller för att omvandla expressionsplasmider ännu inte är tillgängliga. Det är dock enkelt att ändra vissa delar av χCRAC-protokollet för att göra det kompatibelt med CLIP-baserade protokoll som förlitar sig på antikroppar för rening av RBP. Faktum är att denna studie visade att det är möjligt att kombinera iCLIP-baserade reningar med vår tvärbindare. Vi är nu i färd med att utveckla CLIP-protokoll för att studera den tidsmässiga associeringen av humana RNA-bindande proteiner med begynnande RNA-transkript.
Vid χCRAC på ett nytt protein måste UV-exponeringen optimeras för att inducera maximal tvärbindning. Detta är viktigt eftersom höga UV-exponeringar kan minska återhämtningen av RNA under reningssteget. Celler som uttrycker den rekombinanta RBP exponerades för olika UV-doser, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 och 1 J/cm 2. RNP fångades sedan och RNA fragmenterades och radiomärktes. Därefter löstes RNP: erna av SDS-PAGE och ett autoradiogram togs för att härleda vilken exponering som gav den mest intensiva signalen (dvs. maximal tvärbindning).
När experimentella förhållanden har optimerats rekommenderas flera kontrollexperiment när χCRAC utförs. Först kan ett UV-bestrålat, omärkt prov användas för att övervaka bakgrundsbindningen till reningspärlorna. För det andra, när χCRAC appliceras under ett skiftexperiment, möjliggör en andra tidsserie där cellerna flyttas tillbaka till det ursprungliga mediet undersökning av huruvida filtreringen av cellerna i sig inducerar förändringar i RNA-nivåer eller protein-RNA-interaktioner.
Som nämnts i inledningen föreslår många nyligen publicerade artiklar ett antal optimeringar av CLIP-protokollet. Detta inkluderar användning av fluorescerande märkta adaptrar för detektering av protein-RNA-komplexet genom infraröd skanning10 samt optimeringar av olika nukleinsyrarening och storleksvalsteg som visat sig öka komplexiteten hos de resulterande biblioteken 12,45. Vi implementerar för närvarande några av dessa förbättringar för att ytterligare förfina χCRAC-protokollet. Protokollet som presenteras här innehåller redan ett antal förbättringar av de ursprungliga CRAC- och χCRAC-protokollen som ökar komplexiteten hos data. Till exempel, tidigare, efter att ha löst de tvärbundna, radioaktiva protein-RNA-komplexen på SDS-PAGE-geler, överfördes de till ett nitrocellulosamembran och det tvärbundna RNA isolerades från fläcken. Överföringen av RNP och efterföljande RNA-extraktion kan emellertid vara mycket ineffektiv, särskilt när det handlar om stora RBP såsom RNA-polymerasunderenheter. Detta kan resultera i en signifikant minskning av återhämtningen av det tvärbundna RNA. I det nuvarande protokollet extraheras det tvärbundna RNA direkt från SDS-PAGE gelskivor som illustreras i figur 1. Detta ökade återhämtningen av tvärbundna RNA. Dessutom, efter PCR-amplifiering av cDNA: erna löstes produkten ursprungligen på 3%, agarosgeler med låg smälttemperatur och sedan extraherades 175–300 bp PCR-produkter från gelén. Dessa geler kan emellertid lätt överbelastas, vilket resulterar i mycket dålig separation av DNA. Att ersätta agarosgeler med prefabricerade TBE-geler resulterade i en jämnare storleksseparation och bättre återvinning av PCR-produkter.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag från Wellcome Trust (091549 till S.G och 109093/Z/15/A till S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) och Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 till S.G.), European Molecular Biology Organization under ett långsiktigt postdoktoralt stipendium (ALTF 1070-2017 till R.A.C), och Independent Research Fund Denmark (T.H.J).
1,4-dithioreitol | Merck | 10708984001 | Buffer component in mammalian cell lysis |
1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | General reaction tube |
2 mL tubes | Eppendorf | 0030 123.344 | For holding columns and collection of waste |
32P-yATP | Perkin Elmer | NEG502Z-250 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
4-12% Bis-Tris gel | Invitrogen | NP0321BOX | SDS-PAGE gel |
4X loading buffer | Novex | NP0008 | Protein loading dye concentrate |
50 bp ladder | New England Biolabs | N3236 | Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library |
50% PEG | NEB | B100045 | For the L5 linker ligation |
6% TBE gel | Invitrogen | EC6265BOX | For separation and purification of the cDNA library |
Acetone | ACROS Organics | 423245000 | Washing of TCA-precipitated proteins |
anti-FLAG beads | Sigma Aldrich | M8823-1ML | For purifcation of FLAG-tagged RBPs |
ATP (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | R0441 | For ligation of the L5 linker onto the 5' end of captured RNAs |
Beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | Buffer component |
Biomax MS intensifying screen | Sigma Aldrich | Z363162-1EA | For intensifying the autoradiogram signal |
Chloroform | Thermo Fisher Scientific | 1010219 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | For inhibition of cellular proteases after lysis |
Complete supplement mixture -TRP | Formedium | DCS0149 | For preparation of synthetic defined medium |
Costar Spin-X 0.22 µm filters | Sigma Aldrich | CLS8160 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
DNase RQ1 | Promega | M6101 | For DNA digest following cell lysis |
dNTPs (10 mM) | Sigma Aldrich | 4638956001 | For reverse transcription and PCR |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10041814 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen | AM9261 | For protease K buffer |
Exonuclease I | New England Biolabs | M0293 | For degradation of primers following PCR |
Glass microfiber filters | Whatman | 1823-010 | For isolating the excised cDNAs following gel extraction |
Glucose | Formedium | GLU03 | For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium |
Glycogen (20 mg/mL) | Roche | 10901393001 | Precipitation of proteins, RNA and DNA |
GST-TEV | Homemade | Construct and purification protocol is available upon request | |
Guanidium hydrochloroide | Thermo Fisher Scientific | 10071503 | Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer |
IgG beads | GE Healthcare | 17-0969-01 | For purification of protein A-tagged RBPs |
Imidazole | Sigma Aldrich | I2399-100G | For elution of captured proteins from Nickel beads |
Isoamyl alcohol | Thermo Fisher Scientific | A393-500 | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Luna Universal One-Step RT-qPCR | NEB | E3005S | For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles |
Magnesium chloride | Fluka Analytical | 63020-1L | For PNK buffer |
Membrane filters | Millipore | AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria | For vacuum filtration of cells |
Micro bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | For collecting eluate after gel extraction |
Ni-NTA beads | Qiagen | 30210 | For secondary protein capture |
NP-40 | Sigma Aldrich | I8896-100ML | Buffer component |
Pfu polymerase | Promega | M7741 | For amplification of the cDNA library |
Phenol | Sigma Aldrich | P4682-400ML | For phenol-chloroform extraction following RNA purification |
Pierce spin columns | Thermo Fisher Scientific | 69725 | For on-column enzymatic reactions |
Protease K | Roche | 3115887001 | For degradation of the RBP following gel extraction |
Quartz Petri dish | UVO3 | N/A | For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP |
Radiography films | Amersham | 28906843 | For autoradiography visualisation |
RNAClean XP beads | Beckmann | A63987 | SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs |
RNase H | New England Biolabs | M0297 | For degradation of RNAs following reverse transcription |
RNase-It | Agilent | 400720 | For RNA digestion |
rRNasin | Promega | N2511 | For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889-1KG | For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | Buffer component |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-100G | Buffer component in mammalian cell lysis |
Sodium dodecylsulfate | Sigma Aldrich | L3771-1KG | For protease K buffer |
SUPERase-In | Invitrogen | AM2694 | For inhibition of cellular RNases after lysis |
SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | For reverse transcription |
T4 PNK | New England Biolabs | M0201 | For radiolabelling the 5' end of the RNA |
T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204 | For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5' end |
T4 RNase ligase 2, truncated K222Q | NEB | M0351S | For ligation of the App_PE linker onto the 3' end of captured RNAs |
TBE buffer (10X) | Invitrogen | 15581-028 | For running TBE gels |
TEV protease | Homemade | For eluting captured proteins following FLAG capture | |
Thermosensitive alkaline phosphatase | Promega | M9910 | For 5' and 3' dephosphorylation of RNAs |
Trichloroacetic acid (100%) | Sigma Aldrich | T0699-100ML | For precipitation of RBP-RNA complexes |
Tris hydrochloride | Invitrogen | 15504-020 | Buffer component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | Buffer component in mammalian cell lysis |
Vari Filter | UVO3 | N/A | Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP |
Vari-X-Linker | UVO3 | N/A | Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP |
Yeast nitrogen base | Formedium | CYN0410 | For preparation of synthetic defined medium |
Zirconia beads | Thistle | 11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria | For cell lysis via bead beating |