通过质粒DNA拯救重组轮状病毒，为研究轮状病毒的复制机制、致病过程以及开发轮状病毒表达载体和疫苗提供了重要工具。本文介绍一种简化的反向遗传学方法，用于生成重组轮状病毒，包括表达荧光报告蛋白的病毒株。
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本文内容
摘要
摘要
轮状病毒是一类庞大且不断进化的分段双链RNA病毒，可导致多种哺乳动物和禽类宿主（包括人类）幼体发生严重胃肠炎。随着轮状病毒反向遗传学系统的近期建立，现已能够利用定向诱变技术研究轮状病毒生物学特性，改进和优化现有的轮状病毒疫苗，并开发多靶点轮状病毒疫苗载体。本报告中，我们描述了一种简化的反向遗传学系统，可高效、可靠地拯救重组轮状病毒。该系统基于将表达全长轮状病毒(+)RNA的T7转录载体与编码RNA加帽酶的CMV载体共同转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞（BHK-T7）。通过在转染后的BHK-T7细胞中过量接种MA104细胞（一种对病毒增殖高度敏感的猴肾细胞系），可实现重组轮状病毒的扩增。本报告还介绍了一种通过在基因组第7节段（NSP3）中插入2A翻译终止-重启元件，使重组轮状病毒表达独立荧光报告蛋白的方法。该方法无需删除或修改任何病毒开放阅读框，因而可在表达荧光蛋白的同时，保持所有病毒蛋白的完整功能。
引言
轮状病毒是导致婴幼儿以及许多其他哺乳动物和禽类幼体严重胃肠炎的主要原因1。作为呼肠孤病毒科（Reoviridae）的成员，轮状病毒具有分段的双链RNA（dsRNA）基因组。这些基因组片段被包裹在无包膜的二十面体病毒颗粒中，该病毒颗粒由三层同心的蛋白质结构组成2。根据基因组片段的测序和系统发育分析，目前已定义了九种轮状病毒物种（A−D、F−J）3。其中，轮状病毒A种的毒株导致了绝大多数人类感染病例4。在过去十年中，随着轮状病毒疫苗被纳入儿童免疫规划，轮状病毒相关的死亡率和发病率显著下降。尤为显著的是，与轮状病毒相关的儿童死亡人数已从2000年的约528,000例减少至2016年的128,500例4,5。轮状病毒疫苗由减毒活病毒株制成，通常在婴儿6月龄前接种2至3剂。由于在人类及其他哺乳动物中传播的轮状病毒存在大量遗传多样性，并且该病毒可通过突变和基因重配迅速进化，可能导致感染儿童的轮状病毒类型发生抗原性改变6,7,8。此类变化....
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方案
1. 培养基制备与细胞培养维护
- 获取稳定表达T7 RNA聚合酶的幼年仓鼠肾细胞（BHK-T7）以及非洲绿猴肾MA104细胞。
注意：BHK-T7（或BSR-T7）细胞未商业化供应，但为使用反向遗传学研究RNA病毒生物学的实验室中常用的细胞系。本方案所用的BHK-T7细胞系由美国国立卫生研究院（美国马里兰州贝塞斯达，Ursula J. Buchholz博士）提供，该博士是最初表达T7 RNA聚合酶的BHK细胞系的共同开发者29。MA104细胞可从欧洲认证细胞库（ECACC）和美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得。 - 在无菌环境中（最好在II级生物安全柜中）配制以下培养基。将培养基避光保存于4 °C，并在使用前立即升温至37 °C。
注意：培养基成分的来源见材料表。- 配制不完全DMEM培养基：将500 mL含4.5 g/L葡萄糖和1%谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（MEM）与5 mL 100倍青霉素-链霉素溶液（100x pen-strep）混合。
- 配制完全DMEM培养基：将500 mL不完全DMEM培养基与25 mL胎牛血清（FBS）混合。
- 配制不完全GMEM培养基：将500 mL格拉斯哥最低必需培养基、5 mL 100倍谷氨酰胺、50 mL胰蛋白胨磷酸盐肉汤（TPB）、5 mL 100倍非必需氨基酸（....
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结果
本文所述的反向遗传学实验方案包含多个独立步骤：（1）将轮状病毒pT7转录载体与pCMV/NP868R表达质粒共转染至BHK-T7细胞中；（2）用MA104细胞过量接种转染后的BHK-T7细胞；（3）利用MA104细胞扩增BHK-T7/MA104细胞裂解液中存在的重组病毒；（4）使用MA104细胞进行重组病毒的空斑分离（图2）。据我们经验，该方案效率较高，在BHK-T7/MA104细胞裂解液中可获得约104 PFU/mL的重组野生型SA11病毒（rSA11/wt）滴度，在扩增后的MA104细胞裂解液中滴度可达>1 × 107 PFU/mL。通过反向遗传学技术，使用表达荧光蛋白（FP）的修饰型pT7/NSP3SA11质粒（如rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG）所构建的SA11重组病毒，其滴度约为rSA11/wt的1/4。
根据反向遗传学实验方案，我们构建了重组 SA11 病毒，该病毒可在 MA104 细胞上通过空斑实验轻松鉴定，从而实现空斑分离（
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讨论
在我们的实验室中，我们常规依赖本文所述的反向遗传学方案来制备重组SA11轮状病毒。采用该方法，即使缺乏分子生物学技术或轮状病毒操作经验的研究人员，也能在首次尝试时成功获得重组病毒。我们已根据该方案成功构建了近100种重组病毒，其中包括基因组经过重新改造以表达外源蛋白（例如荧光蛋白，FPs）的病毒，以及含有序列插入、缺失和点突变的病毒。
本方案中提供的条件和孵育时间适用于生长良好的重组病毒株的回收。若尝试回收由于基因改造可能导致生长不良的SA11病毒，则应考虑进行调整。特别是，由于此类病毒在转染的BHK-T7/MA014细胞裂解物中的滴度可能较低，我们通常会将后续扩增步骤中用作接种物的裂解物体积加倍。此外，在扩增步骤中，生长缓慢的病毒可能需要更长的孵育时间，才能达到足以收获细胞的细胞病变效应（CPE）水平。实际上，对于这类病毒，我们可能会让感染持续10−14天，甚至更长时间，然后再收获细胞。最后，生长不良的病毒在MA104细胞上可能形成较小且生长缓慢的蚀斑。因此，为了对这些病毒进行蚀斑分离，可能需要在感染后6−10天待蚀斑充分发育后，再用中性红染色细胞并挑取蚀斑。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R03 AI131072和R21 AI144881、印第安纳大学启动资金以及劳伦斯·M·布拉特捐赠基金的支持。我们感谢印第安纳大学Rotahoosier实验室成员、Ulrich Desselberger和Guido Papa在开发反向遗传学实验方案过程中所做出的诸多贡献和提出的宝贵建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 幼仓鼠肾-T7 RNA依赖性RNA聚合酶（BHK-T7）细胞 | 联系人：ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺迷你凝胶 | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 活细胞计数仪 | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP 凝胶成像系统 | Bio-Rad | ||
| 氯仿 | MP | 194002 | |
| Clarity Western 增强型化学发光（ECL）底物 | Bio-Rad | 170-5060 | |
| 感受态大肠杆菌DH5α菌株 | Lucigen | 60602-2 | |
| 完全蛋白酶抑制剂 | Pierce | A32965 | |
| 一次性移液管，超细延长尖端 | MTC Bio | P4113-11 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Lonza | 12-604F | |
| 伊格尔最低必需培养基，2倍浓度（2xEMEM） | Quality Biological | 115-073-101 | |
| 乙醇，无水（200 proof） | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| 溴化乙锭溶液（10 mg/ml） | Invitrogen | 15585-011 | |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | 35-010-CV | |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 抗体，小鼠单克隆 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP 质粒中量提取试剂盒 | Sigma | NA0200-1KT | |
| 遗传霉素（G-418） | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | 低背景荧光的DMEM |
| 格拉斯哥最低必需培养基（GMEM） | Gibco | 11710-035 | |
| 山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记 | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| 豚鼠抗NSP3抗血清 | Patton 实验室 | 批号 55068 | |
| 豚鼠抗VP6抗血清 | Patton 实验室 | 批号 53963 | |
| 马抗豚鼠IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记 | KPL | 5220-0366 | |
| 马抗小鼠IgG，辣根过氧化物酶（HRP）标记 | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco 支原体PCR检测试剂盒 | JH Science | 25235 | |
| 异丙醇 | Macron | 3032-02 | |
| L-谷氨酰胺溶液（100倍浓度） | Gibco | 25030-081 | |
| LB琼脂粉（Miller's LB Agar） | RPI 研究产品 | L24020-2000.0 | |
| 199号培养基（M199）培养液 | Hyclone | Sh30253.01 | |
| 最低必需培养基 - 伊格尔Joklik配方（SMEM） | Lonza | 04-719Q | |
| 猴肾（MA104）细胞 | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One 分光光度计 | ThermoScientific | ||
| 中性红溶液（0.33%） | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| 非必需氨基酸溶液（100倍浓度） | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺迷你凝胶 | Invitrogen | XP00102BOX | |
| 无核酸酶分子生物学级水 | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin 凝胶与PCR产物纯化试剂盒 | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM 减血清培养基 | Gibco | 31985-070 | |
| 研磨杵（无RNase，一次性） | Fisher | 12-141-368 | |
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓度，penn-strep） | Corning | 30-002-Cl | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓度 | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| 猪胰蛋白酶，IX-S型 | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield 质粒微量提取系统 | Promega | A1223 | |
| Qiagen 质粒大量提取试剂盒 | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen 质粒中量提取试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep 离心柱式微量提取试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 转录载体 | Addgene | 89162-89172 | |
| 表达荧光蛋白的SA11 pT7/NSP3转录载体 | 联系人：jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE 琼脂糖 | Lonza | 50000 | 用于凝胶电泳 |
| SeaPlaque 琼脂糖 | Lonza | 50100 | 用于蚀斑试验 |
| Superscript III 一步法RT-PCR试剂盒 | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo 硝酸纤维素转移试剂盒 | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Blot Turbo 转膜系统 | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI 转染试剂 | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-甘氨酸-SDS凝胶电泳缓冲液（10倍浓度） | Bio-Rad | 161-0772 | |
| 吐温X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA提取试剂 | Ambion | 15596026 | |
| 台盼蓝 | Corning | 25-900-CI | |
| 胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.1%）细胞解离液 | Quality Biological | 118-087-721 | |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 | Gibco | 18050-039 | |
| 吐温-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF 溶剂 | Zoro | G0707178 | |
| Zoe 荧光活细胞成像仪 | Bio-Rad |
参考文献
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
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重印与许可
