Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

Summary

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Abstract

Waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) is een krachtige methode voor de biofysische karakterisering van enzym conformationele veranderingen en enzym-substraat interacties. Een van de vele voordelen, HDX-MS verbruikt slechts kleine hoeveelheden materiaal, kan worden uitgevoerd onder bijna inheemse omstandigheden zonder de noodzaak van enzym / substraat etikettering, en kan ruimtelijk opgeloste informatie over enzym conformationele dynamiek - zelfs voor grote enzymen en multiproteïne complexen. De methode wordt geïnitieerd door de verdunning van het enzym van belang in de in D₂O bereide buffer. Dit activeert de uitwisseling van protium in peptide bond amides (N-H) met deuterium (N-D). Op de gewenste uitwisselingstijdpunten worden reactie aliquots gedoofd, wordt het enzym geprotelyseerd tot peptiden, worden de peptiden gescheiden door ultra-performance vloeistofchromatografie (UPLC) en wordt de verandering in massa van elk peptide (als gevolg van de uitwisseling van waterstof voor deuterium) geregistreerd door MS. De hoeveelheid deuteriumopname door elk peptide is sterk afhankelijk van de lokale waterstofbindingsomgeving van dat peptide. Peptiden aanwezig in zeer dynamische gebieden van het enzym uitwisseling deuterium zeer snel, terwijl peptiden afgeleid van goed geordende regio's ondergaan uitwisseling veel langzamer. Op deze manier rapporteert de HDX-rate over lokale enzymconformatiedynamiek. Verstoringen van de deuteriumopnameniveaus in aanwezigheid van verschillende liganden kunnen vervolgens worden gebruikt om ligandbindende locaties in kaart te brengen, allosterische netwerken te identificeren en de rol van conformationele dynamiek in de enzymfunctie te begrijpen. Hier illustreren we hoe we HDX-MS hebben gebruikt om de biosynthese van een type peptide natuurlijke producten genaamd lanthipeptiden beter te begrijpen. Lanthipeptiden zijn genetisch gecodeerde peptiden die post-translationeel worden gewijzigd door grote, multifunctionele, conformationeel dynamische enzymen die moeilijk te bestuderen zijn met traditionele structurele biologiebenaderingen. HDX-MS biedt een ideaal en aanpasbaar platform voor het onderzoeken van de mechanistische eigenschappen van dit soort enzymen.

Introduction

Eiwitten zijn structureel dynamische moleculen die verschillende conformaties bemonsteren op tijdschalen, variërend van femtoseconde-schaal bindingstrillingen tot herschikkingen van hele eiwitdomeinen die gedurende vele seconden kunnen optreden¹. Deze conformationele fluctuaties zijn vaak kritische aspecten van de enzym/eiwitfunctie. Conformationele veranderingen veroorzaakt door ligandbinding zijn bijvoorbeeld vaak van cruciaal belang voor het moduleren van de enzymfunctie, hetzij door het organiseren van actieve plaatsresiduen die nodig zijn voor katalyse, het definiëren van substraatbindende locaties in sequentiële kinetische mechanismen, he....

Protocol

1. Bereiding van gedeutereerde reagentia en enzymvoorraadoplossingen

1. Bereid reagentia die nodig zijn voor de HDX-reacties (inclusief eventuele buffers, zouten, substraten, liganden, enz.) voor als 100−200x geconcentreerde stamoplossingen in D₂O (99,9% atoomfractie D). Bereid ten minste 50 ml buffervoorraadoplossing voor.
   OPMERKING: Voor de karakterisering van HalM2 werden de volgende oplossingen voorbereid: 500 mM MgCl₂, 100 mM tris (2-carboxyethyl)fosfine (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-buffer), 800 mM HEPES pD 7.1, 500 μM HalA2 en 500 mM AMPPNP.
2. Vries en lyofieleer de voorraadoplossingen voor droogheid.
3. Re-dissolve....

Results

Het is noodzakelijk om de kwaliteit van de proteolytische spijsvertering en de reproduceerbaarheid van de workflow voor elke set monsterinjecties te beoordelen. Dus, voorafgaand aan het uitvoeren van HDX-MS-assays, is het essentieel om effectieve voorwaarden vast te stellen voor de proteolyse van het eiwit van belang, voor de scheiding van peptiden met behulp van omgekeerde fase vloeistofchromatografie en gasfase ionenmobiliteit, en voor de detectie van peptiden met behulp van MS. Hiertoe moeten eerst de referentiemonste.......

Discussion

De IN dit protocol gepresenteerde HDX-MS workflow biedt een opmerkelijk robuust platform voor het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van structureel dynamische elementen in eiwitten en voor het onderzoeken hoe deze dynamiek verandert als reactie op verstoring (ligandbinding, enzym mutagenese, etc.). HDX-MS heeft verschillende duidelijke voordelen ten opzichte van andere structurele biologiebenaderingen die vaak worden gebruikt om conformatiedynamiek te onderzoeken. Het meest in het bijzonder zijn slechts klein.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
acetonitrile	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
formic acid	Thermo Fisher	28905
guanidine-HCl	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
Magnesium chloride	SiGMA-Aldrich	63068-250G
Potassium chloride	BioBasic	PB0440
potassium phosphate	BioBasic	PB0445
TCEP Hydrochloride	TRC Canada	T012500	peptide was synthesized upon request
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
software
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Instrument and equipment
ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX System	Waters
HDX Manager	Waters
microtip pH electrode	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters