סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) היא שיטה רבת עוצמה לאפיון ביופיזי של שינויים קונפורמיים של אנזימים ואינטראקציות בין מצע אנזימים. בין היתרונות הרבים שלה, HDX-MS צורכת רק כמויות קטנות של חומר, יכול להתבצע בתנאים מקומיים קרובים ללא צורך תיוג אנזים / מצע, והוא יכול לספק מידע נפתרה spatially על דינמיקה קונפורמציה אנזים-אפילו עבור אנזימים גדולים קומפלקסים multiprotein. השיטה היא ביוזמת דילול של האנזים של עניין לתוך חוצץ מוכן D2O. זה מפעיל את חילופי פרוטיום ב אמיד אג"ח פפטיד (N-H) עם דיטריום (N-D). בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, אליקוטים תגובה מרווה, האנזים הוא proteolyzed לתוך פפטידים, פפטידים מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC), ואת השינוי במסה של כל פפטיד (עקב חילופי מימן עבור דיטריום) נרשם על ידי טרשת נפוצה. כמות ספיגת הדיאוטריום על ידי כל פפטיד תלויה מאוד בסביבת מליטה מימן המקומית של פפטיד זה. פפטידים נוכחים באזורים דינמיים מאוד של דיטריום חילופי אנזימים במהירות רבה, ואילו פפטידים שמקורם באזורים מסודרים היטב עוברים חילופים הרבה יותר לאט. באופן זה, שיעור HDX מדווח על דינמיקה קונפורמציה אנזים מקומי. לאחר מכן ניתן להשתמש בהפרעות לרמות ספיגת הדיטריום בנוכחות ליגנדים שונים כדי למפות אתרי קשירה ליגנד, לזהות רשתות allosteric, ולהבין את התפקיד של דינמיקה קונפורמית בתפקוד האנזים. כאן, אנו ממחישים כיצד השתמשנו ב- HDX-MS כדי להבין טוב יותר את הביוסינתזה של סוג של מוצרים טבעיים פפטיד הנקרא lanthipeptides. Lanthipeptides הם פפטידים מקודדים גנטית כי הם לאחר תרגום שונה על ידי אנזימים גדולים, רב תכליתיים, דינמי קונפורמי שקשה ללמוד עם גישות ביולוגיה מבנית מסורתית. HDX-MS מספק פלטפורמה אידיאלית ומותאמת לבדיקת התכונות המכניסטיות של אנזימים מסוג זה.
מבוא
חלבונים הם מולקולות דינמיות מבחינה מבנית המדגמות קונפורמציות שונות על סולמות זמן החל רטט קשר בקנה מידה femtosecond כדי סידור מחדש של תחומי חלבון שלמים אשר יכול להתרחש על פני שניות רבות1. תנודות קונפורמיות אלה הן לעתים קרובות היבטים קריטיים של תפקוד האנזים/חלבון. לדוגמה, שינויים קונפורמיים הנגרמים על ידי קשירה ליגנד הם לעתים קרובות חשובים ביותר עבור מידול תפקוד האנזים, או על ידי ארגון שאריות אתר פעיל הדרושות לקטליזה, הגדרת אתרי איגוד מצע במנגנונים קינטיים רציפים, הגנה על ביניים תגובתיים מהסביבה, או על ידי היפוך פונקציית האנזים באמצעות רשתות allosteric. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתן לשמר דינמיקה קונפורמטיבית לאורך האבולוציה וכי הפרעה לתנוע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת ריאגנטים מנווטים ופתרונות מלאי אנזימים
- הכן ריאגנטים הדרושים לתגובות HDX (כולל כל מאגרים, מלחים, מצעים, ליגנדים וכו ') כפתרונות מלאי מרוכזים 100-200x ב- D2O (99.9% שבר אטום D). הכן לפחות 50 מ"ל של פתרון מלאי מאגר.
הערה: לאפיון HalM2, הפתרונות הבאים הוכנו: 500 mM MgCl2, 100 מ"מ טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין (TCEP), 750 מ"מ ATP (במאגר HEPES), 800 מ"מ HEPES pD 7.1, 500 מיקרומטר HalA2 ו 500 mM AMPPNP. - להקפיא ולליופיליז את פתרונות המלאי ליובש.
- להתמוסס מחדש ב D2O, ולחזור על מחזור lyophilization לפחות פעם אחת נוספת להחליף כמה שיותר פרוטונים להחלפה עם deuterons ככל האפשר.
- התאם את ה- pD של מלאי מאג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יש צורך להעריך את איכות העיכול הפרוטאוליטי ואת הרבייה של זרימת העבודה עבור כל קבוצה של זריקות מדגם. לכן, לפני ביצוע מבחני HDX-MS, חיוני לקבוע תנאים יעילים לפרוטאואליזה של החלבון המעניין, להפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית פאזה הפוכה וניידות שלב גז יון, ולגילוי פפטידים באמצעות טרשת נפוצה. לשם כך, יש לחקור תחילה את דגימות הייחוס לחלבון המעניין (שנאסף בהיעדר דיטריום) (סעיף 3). הנתונים הכרומטוגרפיים באיור 3A-C מראים את סך כרומטוגרמות היונים (TICs) עבור שלוש דגימות ייחוס ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
זרימת העבודה HDX-MS המוצגת בפרוטוקול זה מספקת פלטפורמה איתנה להפליא למיפוי ההתפלגות המרחבית של אלמנטים דינמיים מבנית בחלבונים ולחקור כיצד דינמיקות אלה משתנות בתגובה לטריאבינציה (קשירה ליגנד, מוטגנזיס אנזים וכו '). HDX-MS מחזיק במספר יתרונות ברורים על פני גישות ביולוגיות מבניות אחרות המשמשות בדרך כלל לחקר הדינמיקה הקונפורמית. בעיקר, רק כמויות קטנות של חלבון נדרשים. באמצעות זרימת העבודה המתוארת במסמך זה, מדגם של 1 מ"ל של חלבון μM אחד מספק מספיק חומר לתגובות HDX משולשות שכל אחת מהן מכילה 5 נקודות זמן החלפה. יתר על כן, אין כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה, פונדס דה Recherche du Quebec Nature et Technologie, הקרן הקנדית לחדשנות, וקרנות הזימון של אוניברסיטת מקגיל.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| [glu-1]-פיברינופפטיד B (Glu-Fib) | BioBasic | NA | |
| 0.5 מ"ל Amicon Ultracel 10k מכשיר סינון צנטריפוגלי (Millipore) | Milipore Sigma | UFC501096 | |
| אצטוניטריל | פישר | A955-1 | |
| AMP-PNP | SIGMA | A2647-25MG | |
| ATP | SIGMA | a2383-5G | |
| D2O | ALDRICH | 435767-100G | |
| חומצה פורמית | תרמו פישר | 28905 | |
| גואנידין-HCl | VWR | 97063-764 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| מגנזיום כלוריד | SiGMA-Aldrich | 63068-250G | |
| אשלגן כלורי | BioBasic | PB0440 | |
| אשלגן פוספט | BioBasic | PB0445 | |
| TCEP הידרוכלוריד | TRC קנדה | T012500 | פפטיד סונתז על פי בקשה |
| שם החומר/ציוד | חברה | מספר קטלוגי | Comments/Description |
| software | |||
| Deuteros | Andy M C Lau, et al | גרסה 1.08 | |
| DynamX | Waters | גרסה 3.0 | |
| Protein Lynx Global Server (PLGS) | Waters | גרסה 3.0.3 | |
| PyMOL | Schrö דינגר | גרסה 2.2.2 | |
| <חזק>שם החומר/ציוד | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות/תיאור/תיאור |
| ><חזק>מכשיר וציוד | |||
| ACQUITY UPLC BEH C18 אנליטי טור | מים | 186002346 | |
| ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard טרום טור | מים | 186003978 | |
| ACQUITY UPLC M-CLASS HDX מערכת | מים | ||
| HDX מנהל | מים | ||
| מיקרוטיפ pH אלקטרודה | תרמו פישר | 13-620-291 | |
| מים Enzymate BEH עמוד או פפסין סולומן | מים | 186007233 | |
| מים סינפט מי |
מקורות
- Karplus, M., McCammon, J. A. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural & Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).
- Campbell, E., et al. The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function. Nature Chemical Bi....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
