अवक्रमित एफएफपीई-आरएनए नमूनों के अनुक्रमण और विश्लेषण के लिए अनुकूलन
Summary
यह विधि अनुक्रम डेटा की गुणवत्ता और मात्रा में सुधार करने के लिए कदमों का वर्णन करती है जिसे फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) आरएनए नमूनों से प्राप्त किया जा सकता है। हम एफएफपीई-आरएनए नमूनों की गुणवत्ता का अधिक सटीक आकलन करने, अनुक्रमण पुस्तकालयों को तैयार करने और एफएफपीई-आरएनए नमूनों के आंकड़ों का विश्लेषण करने की कार्यप्रणाली का वर्णन करते हैं।
Abstract
आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण नैदानिक नमूनों में अद्वितीय अंतर्दृष्टि को सक्षम बनाता है जो संभावित रूप से विभिन्न रोगों के आधार के साथ-साथ प्रतिरोध और/या संवेदनशीलता तंत्र की मशीनी समझ का कारण बन सकता है। हालांकि, FFPE ऊतकों, जो नैदानिक नमूनों में ऊतक आकृति विज्ञान के संरक्षण के लिए सबसे आम विधि का प्रतिनिधित्व करते हैं, जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा स्रोत नहीं हैं । ऐसे नमूनों से प्राप्त आरएनए को अक्सर अपमानित, खंडित और रासायनिक रूप से संशोधित किया जाता है, जिससे पुस्तकालयों को उप-इष्टतम अनुक्रमण होता है। बदले में, ये खराब गुणवत्ता अनुक्रम डेटा उत्पन्न करते हैं जो जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और उत्परिवर्तन खोज के लिए विश्वसनीय नहीं हो सकते हैं। एफएफपीई नमूनों का सबसे अधिक बनाने और कम गुणवत्ता वाले नमूनों से सर्वोत्तम संभव डेटा प्राप्त करने के लिए, प्रायोगिक डिजाइन की योजना बनाते समय, अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी करते समय और डेटा विश्लेषण के दौरान कुछ सावधानियां बरतना महत्वपूर्ण है। इसमें सटीक नमूना गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) के लिए उपयुक्त मैट्रिक्स का उपयोग, अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पादन के दौरान विभिन्न चरणों के लिए सर्वोत्तम तरीकों की पहचान करना, और सावधान लाइब्रेरी क्यूसी शामिल है। इसके अलावा, आरएनए-सीक्यू डेटा में कलाकृतियों की पहचान करने, संदूषण और निम्न गुणवत्ता वाले पढ़ने, जीन कवरेज की एकरूपता का आकलन करने और जैविक प्रतिकृतियों के बीच जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की प्रजनन क्षमता को मापने के लिए अनुक्रम डेटा विश्लेषण के लिए सही सॉफ्टवेयर उपकरण और मापदंडों को लागू करना महत्वपूर्ण है। ये कदम बहुत विषम आरएनए नमूनों की प्रोफाइलिंग के लिए उच्च सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित कर सकते हैं। यहां हम नमूना क्यूसी, लाइब्रेरी तैयार करने और क्यूसी, अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण के लिए विभिन्न चरणों का वर्णन करते हैं जो कम गुणवत्ता वाले आरएनए से प्राप्त उपयोगी डेटा की मात्रा को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं, जैसे कि एफएफपीई-आरएनए ऊतकों से प्राप्त।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोणों के उपयोग ने हमें विभिन्न प्रकार के नमूनों से जानकारी का खजाना बीनने में सक्षम बनाया है । हालांकि, पुराने और खराब संरक्षित नमूने अनुक्रम डेटा उत्पन्न करने के आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों के लिए असाध्य रहते हैं और अक्सर अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल में संशोधनों की आवश्यकता होती है। एफएफपीई ऊतक ऐसे नमूना प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं जिनका नैदानिक नमूनों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है1,2,,3. जबकि एफएफपीई संरक्षण ऊतक आकृति विज्ञान को बनाए रखता है, एफएफपीई ऊतकों में न्यूक्लिक एसिड आमतौर पर क्षति और क्षरण की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शित करते हैं, जिससे जीनोमिक जानकारी को पुनः प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है जिससे विभिन्न विकारों में अंतर्निहित आणविक तंत्रके बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हो सकती है।
आरएनए अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न जीन अभिव्यक्ति डेटा अक्सर रोग और प्रतिरोध तंत्र का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और डीएनए उत्परिवर्तन विश्लेषण का पूरक होता है। हालांकि, आरएनए गिरावट के लिए अधिक संवेदनशील है, जिससे एफएफपीई ऊतकों से सटीक जीन अभिव्यक्ति डेटा उत्पन्न करना अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इसके अलावा, क्योंकि अनुक्रमण की व्यापक उपलब्धता और सामर्थ्य अपेक्षाकृत हाल ही में है, पुराने नमूनों को अक्सर आरएनए अखंडता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक शर्तों में संग्रहीत नहीं किया गया था। एफएफपीई नमूनों के लिए कुछ मुद्दों में पैराफिन में एम्बेड करने के कारण आरएनए का क्षरण, आरएनए का रासायनिक संशोधन अनुक्रमण के लिए आवश्यक एंजाइमैटिक प्रक्रियाओं के विखंडन या अपवर्तकता के लिए अग्रणी है, और पॉली-ए पूंछ का नुकसान, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस4के लिए एक प्राइमर के रूप में ओलिगो-डीटी की प्रयोज्यता को सीमित करता है। एक अन्य चुनौती उप-इष्टतम परिस्थितियों में एफएफपीई नमूनों की हैंडलिंग/भंडारण है, जिससेऊतकोंमें आरएनए जैसे लेबिल अणुओं का और क्षरण हो सकता है । यह पुराने नमूनों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जो ऐसे समय में एकत्र किया गया हो सकता है जब आरएनए अनुक्रमण द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण नमूनों के लिए प्रत्याशित नहीं था। इन सभी के कारण उपयोगी अनुक्रम डेटा उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता और मात्रा में कमी आई है। सफलता की कम संभावना, अनुक्रमण की उच्च लागत के साथ संयुक्त, संभावित उपयोगी FFPE नमूनों से जीन अभिव्यक्ति डेटा उत्पन्न करने और विश्लेषण करने की कोशिश कर रहा से कई शोधकर्ताओं परहेज किया है । हाल के वर्षों में कुछ अध्ययनों जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण2,66,77,88,9के लिए FFPE ऊतकों की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया है, हालांकि कम और/या अधिक हाल के नमूनों के लिए ।,
एक व्यवहार्यता अध्ययन के रूप में, हमने एफएफपीई ट्यूमर ऊतक नमूनों से निगरानी, महामारी विज्ञान, और अंतिम परिणाम (SEER) आरएनए अनुक्रमण और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण10के लिए अंतिम परिणाम (SEER) कैंसर रजिस्ट्रियों से निकाले गए आरएनए का उपयोग किया। नैदानिक पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं से खरीदा गया, उच्च ग्रेड ओवेरियन सीरस एडेनोकार्सिनोमा से एफएफपी ऊतकों को आरएनए निष्कर्षण से पहले अलग-अलग परिस्थितियों में 7-32 वर्षों से संग्रहित किया गया था। क्योंकि ज्यादातर मामलों में इन ब्लॉकों को भविष्य में किसी भी संवेदनशील आनुवंशिक विश्लेषण की उम्मीद के बिना वर्षों के लिए विभिन्न साइटों में संग्रहीत किया गया था, नाभिक एसिड को संरक्षित करने के लिए बहुत सावधानी नहीं बरती गई थी। इस प्रकार, अधिकांश नमूनों ने खराब गुणवत्ता वाले आरएनए का प्रदर्शन किया, जिसमें बैक्टीरिया से दूषित नमूनों का एक बड़ा हिस्सा था। फिर भी, हम जीन क्वांटिफिकेशन करने, जीन कवरेज की एकरूपता और निरंतरता को मापने और प्रजनन क्षमता को मापने के लिए जैविक प्रतिकृतियों के बीच पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण करने में सक्षम थे। प्रमुख हस्ताक्षर जीन पैनल के एक सेट के आधार पर, हम कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) डेटा के साथ हमारे अध्ययन में नमूनों की तुलना में और पुष्टि की है कि नमूनों के लगभग ६०% तुलनीय जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल11था । विभिन्न क्यूसी परिणामों और नमूना मेटाडेटा के बीच सहसंबंध के आधार पर, हमने प्रमुख क्यूसी मैट्रिक्स की पहचान की, जिनमें नमूनों की पहचान करने के लिए अच्छा भविष्य कहनेवाला मूल्य है जो उपयोग करने योग्य अनुक्रम डेटा11उत्पन्न करने की अधिक संभावना रखते हैं।
यहां हम एफएफपीई-आरएनए गुणवत्ता मूल्यांकन, निकाले गए आरएनए नमूनों से शुरू होने वाले अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी और अनुक्रमण डेटा के बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि FFPE-RNA नमूनों से अच्छा अनुक्रम डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक मुख्य चरणों को रेखांकित करती है । इस विधि के साथ विचार करने के लिए मुख्य बिंदु हैं: (1) यह सुनिश्चित करें कि आरएनए को नमूना हैंड…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ डेनिएल कैरिक (कैंसर नियंत्रण और जनसंख्या विज्ञान, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के प्रभाग) के लिए जारी मदद के लिए आभारी हैं, विशेष रूप से इस अध्ययन शुरू करने के लिए, हमें नमूनों के साथ प्रदान करने, और डेटा विश्लेषण के दौरान उपयोगी सुझावों के लिए । हम ईमानदारी से नमूना तैयारी और अनुक्रमण के दौरान उनकी मदद के लिए कैंसर अनुसंधान के लिए फ्रेडरिक राष्ट्रीय प्रयोगशाला में सीसीआर अनुक्रमण सुविधा के सभी सदस्यों को धन्यवाद, नमूना QC में सहायता के लिए विशेष रूप से Brenda हो, पुस्तकालय QC के लिए Oksana जर्मन, तात्याना Smirnova अनुक्रमक चलाने के लिए । हम डेटा विश्लेषण और आरएनए-सीक्यू पाइपलाइन कार्यान्वयन के साथ मदद करने के लिए अनुक्रमण सुविधा बायोइन्फॉर्मेटिक्स समूह में टीएसएआई-वेई शेन और एशले वाल्टन का भी शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम RNaseq विश्लेषण पाइपलाइन और सर्वोत्तम प्रथाओं के विकास के साथ सहायता के लिए सीसीबीआर और एनसीबीआर को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Agilent DNA 7500 Kit | Agilent | 5067-1506 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE Kit | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Library Quantification kit v2-Illumina | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | New England Biolabs | E6310L | |
| NextSeq 500 Sequencing System | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS) | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics Magnetic Separator | 10X Genomics | 120250 | |
| Rotator Multimixer | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
| Sequencing reagent kit | Illumina | 20024907 | |
| Flow cell package | Illumina | 20024907 | |
| Buffer cartridge and the reagent cartridge | Illumina | 20024907 | |
| Sodium hydroxide solution (0.2N) | Millipore Sigma | SX0607D-6 | |
| TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
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