En planarisk motilitetsanalyse for å måle de biomodulerende egenskapene til naturlige produkter

Summary

Planarian motilitet brukes til å måle stimulerende og abstinensegenskaper av naturlige produkter sammenlignet med bevegelsen av dyrene i kildevann alene.

Abstract

En enkel, kontrollerbar måte å bruke ikke-parasittiske planarian, Dugesia tigrina, en frittlevende akvatisk flatworm, å studere stimulerende og abstinens egenskaper av naturlige produkter er beskrevet. Eksperimentelle analyser som drar nytte av unike aspekter ved planarian fysiologi har blitt brukt på studier på sårheling, regenerering og tumorigenesis. I tillegg, fordi planarianere viser følsomhet for en rekke miljøstimuli og er i stand til å lære og utvikle bevisste svar, kan de brukes i atferdsstudier som undersøker læring og minne. Planarianere har en grunnleggende bilateral symmetri og et sentralnervesystem som bruker nevrotransmittersystemer mottagelige for studier som undersøker effekten av nevromuskulære biomodulatorer. Derfor er eksperimentelle systemer overvåking planarian bevegelse og motilitet utviklet for å undersøke stoffavhengighet og tilbaketrekking. Fordi planarisk motilitet gir potensialet for et følsomt, lett standardisert motilitetsanalysesystem for å overvåke effekten av stimuli, ble den planariske lokomotoriske hastighetstesten (pLmV) tilpasset for å overvåke både stimulering og abstinensatferd av planarianere gjennom fastsettelse av antall rutenettlinjer krysset av dyrene med tiden. Her er teknikken og dens anvendelse demonstrert og forklart.

Introduction

Protokollen som beskrives bruker planær motilitet for å gi et middel til å vurdere de biomodulerende effektene av naturlige stoffer. Det ble spesielt tilpasset for å avgjøre om disse stoffene fungerer som sentralstimulerende midler, og hvis de da var forbundet med en målbar uttaksatferd¹. Denne analysen, kjent som den planariske lokomotoriske hastighetstesten (pLmV), ble først brukt til å teste kjente farmakologiske^{midler 2,3}. Anvendelsen av denne planære motilitetsbaserte analysen har siden vokst i popularitet og har blitt vedtatt av forskjellige laboratorier som er interessert i andre stoffer enn naturlige^{produkter 4,5}. For denne analysen er en planarian plassert i en petriskål som inneholder kildevann eller kildevann som inneholder en oppløst biomodulator. Fordi selve fatet er plassert på grafpapir, kan antall rutenettlinjer krysset av dyret med tiden når den beveger seg om beholderen, brukes til å bestemme bevegelseshastigheten i hver tilstand. Den lyse/mørke testen, ellers referert til som den bedede stedspreferansetesten (CPP), er en annen variasjon på temaet overvåking av planær motilitet, og vurderer hvor raskt dyrene reagerer og migrerer til et mørkt miljø^6,7. Videosporing av planære bevegelser kan også analyseres ved hjelp av dataprogrammer og senter for massesporing (COM)^{sporing 8,,9,,10,,11}.

Å bruke planarian som dyremodell for slike studier gir flere fordeler fremfor andre dyr ved at eksperimentereren enkelt kan kontrollere analysemiljøet. Spesielt, sulte planarians før eksperimentering kan hindre deres eksponering for andre ernæringsmessige eller farmakologiske midler som ellers kan forvirre resultatene, og den spesifikke biomodulatoren under undersøkelse kan innføres til planarianerne bare ved å legge den direkte til kulturvannet, og dermed standardisere eksponering. Siden planarianere har et nervesystem og nevrotransmittere som minner om “høyere orden” dyr, fysiologi og eksperimentelle reaksjoner av disse dyrene til nevromuskulære stimuli anses biologisk relevant for andre^{organismer 12,13,14,15,16}. Også, fordi planarianere er relativt billig og grei å vedlikeholde i laboratoriet, tilbyr de en tilgjengelig biologisk modell for mange etterforskere.

Som et eksperimentelt dyr er planarianere egnet til et bredt spekter av studier. For eksempel bruker vår gruppe, samt andre forskere planarianere til å studere tumorigenesis^17,18,19. Planarians viser også en rekke responsatferd til kjemiske, termiske, gravitasjons-, elektriske, foto- og magnetiske stimuli som har dannet grunnlaget for andre analysesystemer. Noen av disse effektene har blitt brukt til å studere læring og minne hos disse dyrene^{20,21,22,23,24,25,26,27}. Den primære bruken av den planære modellen i litteraturen i dag fokuserer på aktiviteten til planære pluripotente stamceller, kalt neoblaster, og deres rolle i^{regenerering 28,29,30}. Ved å vedta modellen som er beskrevet her, kan det derfor muliggjøre videre studier ved hjelp av andre planære analyser for å gi en bredere forståelse av hvordan naturlige produkter og andre biomodulatorer påvirker organismen.

Protocol

1. Planarisk husdyrhold Bruk planarianere kjøpt fra et biologisk forsyningsselskap eller villfanget om nødvendig. Planarianerne som brukes i denne protokollen er Dugesia tigrina, som oppført i forsyningslisten. Denne arten er også referert til som Girardia tigrina31. Andre akvatiske planære arter er ogsåakseptable 2,3.MERK: Protokollen som er beskrevet er rettet mot dyr kjøpt fra et biologisk forsynin…

Representative Results

Laboratoriet som er konfigurert og klargjøring av arbeidsområdet for å kjøre pLmV-analysen, bør fullføres før eksperimenteringen begynner. Dette inkluderer utarbeidelse av habituation container, skyll beholder om nødvendig (for uttak eksperimenter), Petri parabolen over laminert rutenett papir, og riktig plassert kamera (Figur 1). Når alle videoene er tatt, er det tilrådelig å bruke et felles dataark for å standardisere datainnsamling og presentasjon mellom undersøkere (<strong …

Discussion

En enkel og tilgjengelig planarisk motilitetsanalyse er beskrevet for å bestemme stimulerende og abstinenseffekter av naturlige produkter. Som atferdsmodell er det nødvendig å ha strenge protokoller for å score bevegelse og klare definisjoner av atferd for å standardisere observasjoner mellom ulike eksperimenterere. Ideene som presenteres, gir en demonstrasjon av hvordan dette kan oppnås. Hvert laboratorium som bruker denne protokollen, bør tilpasse den presenterte informasjonen slik at den passer til effekten av …

Materials

Bottled Water – 1 Gal.	Poland Spring	N/A	Spring water for planarian culture and to prepare solutions
Brown Planaria (Dugesia tigrina)	Carolina Biological Supply Company	132954	Brown planaria living (other species are acceptable)
Flat Paintbrush	Royal Crafter's Choice	9159	Flat watercolor paintbrushes for cleaning planarian culture containers
Glass Petri Dish – 10 cm	Kimax	N/A	10 cm diameter (glass) Petri dishes for pLmV assay
Glass Petri Dish – 5 cm	Kimax	N/A	5 cm and Petri dishes for rinsing planarians during withdrawal experiments and for stimulant habituation
Grid Paper	Any	N/A	Standard 0.5 cm grid paper for pLmV assay
iPEVO Visualizer (software)	iPEVO	https://www.ipevo.com/software/visualizer	Document camera software for video capture and recording
Metalware Set with Support Stand and Retort Ring	Any	N/A	Standard chemistry lab ring stand to hold a cell phone camera if used
Organic Egg	Any	N/A	Organic egg or beef liver for feeding planarains
Polycarbonate Bottle w/ Screw-on Cap – 10 mL	Beckman	N/A	Plastic vials to hold 5 to 10 mL volumes for stimulant habituation
Round Storage Container – 10 cm	Ziploc	N/A	10 cm Round food storage containers for approximately 90 planarians or fewer
Round Water Paint Brush	LOEW-Cornell	N/A	Small round watercolor paint brushes (numbers 3 to 6) – soft
Transfer Pipette	Any	N/A	Wide bore (5 mL) plastic transfer pipettes to move planarians
USB Document Camera	iPEVO	CDVU-06IP	Document camera (or other camera or cell phone camera)