अलगाव, ट्रांसफैक्शन, और वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति
Summary
यहां, हम वयस्क माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव, ट्रांसफैक्शन और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
वयस्क स्तनधारी कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) की पूर्व वीवो संस्कृति कार्डियक जीव विज्ञान के इन विट्रो अध्ययन के लिए सबसे प्रासंगिक प्रायोगिक प्रणाली प्रस्तुत करता है। वयस्क स्तनधारी सीएम न्यूनतम प्रसार क्षमता के साथ मरणासन्न विभेदित कोशिकाएं हैं। वयस्क सीएम के बाद मिटोटिक राज्य न केवल कार्डियोमायोसाइट सेल चक्र प्रगति को प्रतिबंधित करता है बल्कि सीएम की कुशल संस्कृति को भी सीमित करता है। इसके अलावा, वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति कई अध्ययनों के लिए आवश्यक है, जैसे सीएम प्रसार और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण।
माउस और चूहा कार्डियोमायोसाइट अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले दो सबसे पसंदीदा प्रयोगशाला जानवर हैं। जबकि चूहे के केंद्रीयमों की दीर्घकालिक संस्कृति संभव है, वयस्क माउस सीएम मौत के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और सामान्य परिस्थितियों में पांच दिनों से अधिक सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। इसलिए, वयस्क मुरीन सीएम के लिए सेल अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ, 20 से अधिक दिनों के लिए वयस्क माउस और चूहा सीएम दोनों को सफलतापूर्वक अलग और संस्कृति करना संभव है। इसके अलावा, पिछली रिपोर्टों की तुलना में अलग-थलग पड़े सीएम की सिरना ट्रांसफैक्शन दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। वयस्क माउस सीएम अलगाव के लिए, लैंगेंडोर्फ परफ्यूजन विधि का उपयोग इष्टतम एंजाइम समाधान और पूर्ण बाह्य मैट्रिक्स वियोजन के लिए पर्याप्त समय के साथ किया जाता है। शुद्ध वेंट्रिकुलर सीएम प्राप्त करने के लिए, दोनों अटरिया को असंबद्धता और चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने से पहले विच्छेदित और त्याग दिया गया था। कोशिकाओं को एक लेमिनिन लेपित प्लेट पर फैलाया गया था, जो कुशल और तेजी से लगाव के लिए अनुमति दी गई थी। सीरना ट्रांसफैक्शन से पहले सीएम को 4-6 घंटे के लिए बसने की अनुमति दी गई थी । संस्कृति मीडिया को 20 दिनों के लिए हर 24 घंटे में ताज़ा किया गया था, और बाद में, सीएम को कार्डियक-विशिष्ट मार्कर जैसे ट्रोपोनिन और सेल चक्र के मार्कर जैसे KI67 के लिए तय और दाग दिया गया था।
Introduction
हृदय रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक हैं। लगभग सभी प्रकार के हृदय की चोट के परिणामस्वरूप वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) का एक महत्वपूर्ण नुकसान होता है। वयस्क स्तनधारी हृदय वयस्क मुख्यमंत्री1की कामुक प्रकृति के कारण अपनी हृदय की चोट की मरम्मत करने में असमर्थ हैं । इस प्रकार, वयस्क स्तनधारी दिल के किसी भी अपमान के परिणामस्वरूप सीएम की स्थायी हानि होती है, जिससे हृदय कार्य और हृदय की विफलता कम हो जाता है। वयस्क स्तनधारियों के विपरीत, जेब्राफिश और न्यूट हार्ट्स जैसे छोटे जानवर मौजूदा सीएम प्रसार2,,3,4 के माध्यम से अपनी हृदय की चोट को पुनर्जीवित करसकते4हैं। एक विश्वव्यापी प्रयास दोनों प्रसारीय और गैर-प्रसारीय दृष्टिकोणों के माध्यम से हृदय की चोट के लिए एक उपन्यास चिकित्सीय हस्तक्षेप खोजने के लिए चल रहा है। पिछले दशकों में, हृदय की चोट और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक माउस मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, वीवो पशु मॉडल में उपयोग करने के लिए अतिरिक्त जटिलता के साथ एक महंगा दृष्टिकोण के लिए माध्यमिक प्रभाव से एक सेल स्वायत्त तंत्र समझने के लिए जारी है । इसके अलावा, वीवो सिस्टम में सीएम से कार्डियोप्रोटेक्टिव सिग्नलिंग को प्रेरित करने वाले औषधीय हस्तक्षेप के सीएम विशिष्ट प्रभावों का विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है।
इसके अलावा, सीएम प्रसार विश्लेषण करने के लिए वयस्क सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति आवश्यक है। सीएम प्रसार परख कोशिकाओं को कोशिका चक्र में प्रेरित करने और उसके बाद सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है । इसके अतिरिक्त, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन, दवा स्क्रीनिंग, विषाक्तता अध्ययन और सीए++ होमोस्टेसिस अध्ययन के लिए अलग-थलग पड़े सीएम का उपयोग करने वाले अध्ययनों को,बेहतर संस्कृति प्रणाली5,,6,7की आवश्यकता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि सीएमएस (कार्डियोकिन्स)8,,9से स्रावित साइटोकिन्स का कार्डियोप्रोटेक्टिव महत्व है। दिल की मरम्मत और उत्थान के दौरान इन कार्डियोकिन्स की चिकित्सीय भूमिका और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, एक लंबे समय तक संस्कृति की आवश्यकता होती है।
वयस्क चूहा सीएम एक इन विट्रो सिस्टम10, 11, 12में एकल कोशिका अलगाव औरदीर्घकालिक,12संस्कृति के लिए काफी मजबूत हैं।, हालांकि, वयस्क माउस सीएम इन विट्रो परख के लिए बहुत रुचि रखते हैं, विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता के कारण, जो चूहे सीएम13के साथ विभिन्न अभिनव विश्लेषणों के डिजाइन और निष्पादन की अनुमति देता है। वयस्क चूहा मुख्यमंत्री अलगाव के विपरीत, वयस्क माउस दिलों से एकल-कोशिका निलंबन प्राप्त करना काफी चुनौतीपूर्ण है, और संस्कृति में वयस्क माउस सीएम की दीर्घकालिक संस्कृति और भी चुनौतीपूर्ण है।
लंगेंडोर्फ प्रणाली का उपयोग करके माउस और चूहे के दिलों से वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव पहले 5,14 ,15सीएम समारोह का अध्ययन करने के लिए,स्थापितकिया गया है ।14 यहां, हमने चूहों और चूहों दोनों से वयस्क सीएम अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के साथ-साथ एक संशोधित दीर्घकालिक संस्कृति, ट्रांसफैक्शन और अलग-थलग कोशिकाओं के सीएम प्रसार के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सेल-विशिष्ट मशीनी अध्ययन करने के लिए वयस्क कार्डियोमायोसाइट अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करने की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। वयस्क मुख्यमंत्री अलगाव प्रोटोकॉल पर चर्चा ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को पैथोलॉजी और प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग, सिनसिनाटी विश्वविद्यालय, कॉलेज ऑफ मेडिसिन, डॉ ओनुर कानिसिकक से वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (R01HL148598) से डॉ ओनूर कानिसिकक को अनुदान । डॉ ओनुर कानिसिकक को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (18CDA34110117) का समर्थन है । डॉ परवेज आलम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पोस्टडॉक्टोरल ग्रांट (AHA_20POST35200267) का समर्थन है । डॉ मलीना जे Ivey एक NIH T32 अनुदान (एचएल 125204-06A1) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
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