成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養
Summary
ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。
Abstract
成人哺乳類心筋細胞(CM)のエクスビボ培養は、心臓生物学のインビトロ研究に最も関連する実験システムを提示する。成人哺乳類のCMは、増殖能力が最小の末端分化細胞である。成人CMのポストミトティック状態は、心筋細胞周期の進行を制限するだけでなく、CMの効率的な培養を制限します。また、CMの増殖や遺伝子発現の解析など、多くの研究には成人CMの長期培養が必要です。
マウスとラットは、心筋細胞の分離に使用される2つの最も好ましい実験動物である。ラットCMの長期培養は可能ですが、成虫マウスCMは死亡しやすく、通常の条件下では5日以上培養できません。したがって、成人マウスのCMの細胞分離および長期培養プロトコルを最適化する必要があります。この変更されたプロトコルを使用すると、成体マウスとラットの両方のCMを20日以上正常に分離および培養することが可能です。さらに、単離されたCMのsiRNAトランスフェクション効率は、以前の報告に比べて有意に増加する。成人マウスCMの分離のために、ランゲンドルフ灌流法は、最適な酵素溶液と完全な細胞外マトリックス解離のための十分な時間で利用される。純粋な心室CMを得るために、両方の心房を解剖し、解離およびめっきを進める前に廃棄した。細胞をラミニンコーティングされたプレート上に分散させ、効率的かつ迅速な付着を可能にした。CMは、siRNAトランスフェクションの前に4〜6時間沈着させた。培養培地を24時間ごとに20日間リフレッシュし、その後、トロポニンなどの心臓特異的マーカーやKI67などの細胞周期のマーカーについてCMを固定し染色した。
Introduction
心臓病は、世界中の主要な死因の一つです。ほとんどすべてのタイプの心障害は、成人心筋細胞(CM)の有意な喪失をもたらす。成人哺乳類の心臓は、成人のCM1の老化性のために心臓損傷を修復することができない。したがって、成人哺乳類の心臓に対する侮辱は、CMの永久的な喪失をもたらし、心機能および心不全の減少をもたらす。成人哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュやイニュートハートのような小動物は、既存のCM増殖22、3、43,4を通じて心臓損傷を再生することができる。世界的な取り組みは、増殖と不拡散の両方のアプローチを介して心臓傷害に対する新たな治療介入を見つけ出すために進行中である。過去数十年の間に、様々なタイプの遺伝的マウスモデルが心臓損傷および修復を研究するために開発された。しかし、in vivo動物モデルを使用することは、二次的な効果から細胞自律機構を解読するための追加の複雑さを伴う高価なアプローチであり続けています。また、生体内システムは、CMから心保護シグナル伝達を誘導する薬理学的介入のCM特異的効果を分析することは困難である。
さらに、CM増殖解析を行うためには、成人CMの長期培養が必要である。CM増殖アッセイは、細胞が細胞周期に誘導され、その後正確なデータを得るために最低4〜5日を必要とする。さらに、電気生理学的研究、薬物スクリーニング、毒性試験、およびCa++ホメオスタシス研究のために単離されたCMを利用する研究は、すべて改善された培養系5、6、76を必要と7している。5さらに、最近の研究では、CM(カーディオカイン)8,9,9から分泌されるサイトカインの心保護的意義を示す。心臓の修復と再生の間にこれらのカーディオキンの治療的役割と分子機構を調べるには、長期培養が必要である。
成人ラットのCMは、インビトロシステム10、11、12,11,12における単細胞単細胞分離および長期培養に十分に堅牢である。しかし、成虫マウスCMは、ラットCM13では不可能な様々な革新的な分析の設計と実行を可能にする様々な遺伝子組み換えマウスモデルの入手可能性のために、インビトロアッセイに大きな関心を持っています。成体ラットCMの分離とは対照的に、成体マウスの心臓から単細胞懸濁液を得ることは非常に困難であり、培養中の成体マウスCMの長期的な培養はさらに困難である。
ランゲンドルフシステムを使用したマウスとラットの心臓からの成人のCM分離は、以前にCM機能55、14、1514,15を研究するために確立されています。ここでは、ラットおよびマウスの両方からの成人CM単離のためのプロトコル、ならびに単離細胞の修飾された長期培養、トランスフェクション、およびCM増殖について詳細に説明した。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞特異的な機械学的研究を行うために、成人心筋細胞単離および長期培養のためのプロトコルを確立することが重要である。成人の CM 分離プロトコルについて説明する報告はごくわずかで、さらに少ない数が成体マウス CM15、16、1716,17の長期培養に使用されます。15成体ラットCMは、成体マウスCM10、11、12</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、シンシナティ大学医学部の病理学・検査医学科からオヌール・カニシカ博士への資金提供によって支えられた。国立衛生研究所(R01HL148598)からオヌール・カニシカク博士への助成金。オヌール・カニシカク博士は、米国心臓協会キャリア開発賞(18CDA34110117)の支援を受けています。パーウェス・アラム博士は、米国心臓協会の博士研究員(AHA_20POST35200267)によって支えられている。マリナ・J・アイビー博士は、NIH T32助成金(HL 125204-06A1)によってサポートされています。
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
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