Isolation, transfektion og langsigtet kultur af voksne mus og rat kardiomyocytter
Summary
Her præsenterer vi en protokol for isolation, transfektion, og langsigtet kultur af voksne mus og rotte kardiomyocytter.
Abstract
Ex vivo kultur af voksne pattedyr kardiomyocytes (CMs) præsenterer den mest relevante eksperimentelle system for in vitro undersøgelse af hjertebiologi. Voksne pattedyr-CMs er terminalt differentierede celler med minimal spredningskapacitet. Den post-mitotiske tilstand af voksne CMs ikke kun begrænser cardiomyocyte celle cyklus progression, men også begrænser den effektive kultur AF CMs. Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMs er nødvendig for mange undersøgelser, såsom CM spredning og analyse af genekspression.
Musen og rotten er de to mest foretrukne laboratoriedyr, der skal anvendes til kardiomyocyt isolation. Mens den langsigtede kultur af rotte CMs er muligt, voksne mus CMs er modtagelige for døden og kan ikke dyrkes mere end fem dage under normale forhold. Derfor er der et kritisk behov for at optimere celleisolering og langsigtet kultur protokol for voksne murine CMs. Med denne ændrede protokol er det muligt at isolere og kultur både voksne mus og rotte-CM’er i mere end 20 dage. Desuden er siRNA transfektionseffektiviteten af isoleret CM steget betydeligt sammenlignet med tidligere rapporter. Til isolering af voksenmus CM anvendes Langendorff perfusionsmetoden med en optimal enzymopløsning og tilstrækkelig tid til fuldstændig ekstracellulær matrixdissociation. For at opnå rene ventrikulære CMs, både atria blev dissekeret og kasseret, før du fortsætter med disassociation og plating. Celler blev spredt på en laminin belagt plade, som gav mulighed for effektiv og hurtig fastgørelse. CMs fik lov til at nøjes med 4-6 timer før siRNA transfektion. Kulturmedier blev opdateret hver 24 timer i 20 dage, og efterfølgende blev CMs repareret og plettet for hjertespecifikke markører som Troponin og markører for cellecyklus som KI67.
Introduction
Hjertesygdomme er en af de førende dødsårsager på verdensplan. Næsten alle typer af hjerteskader resultere i et betydeligt tab af voksne kardiomyocytter (CMs). Voksne pattedyr hjerter er ude af stand til at reparere deres hjerteskade på grund af senescent karakter af den voksne CM1. Således, enhver fornærmelse mod den voksne pattedyr hjerte resulterer i et permanent tab af CO’er, fører til nedsat hjertefunktion og hjertesvigt. I modsætning til voksne pattedyr, små dyr som zebrafisk og newt hjerter kan regenerere deres hjerteskade gennem eksisterende CM spredning2,3,4. En verdensomspændende indsats er i gang for at finde en ny terapeutisk intervention for hjerteskader via både proliferative og ikke-proliferative tilgange. I de seneste årtier, forskellige typer af genetiske musemodeller er blevet udviklet til at studere hjerteskader og reparation. Men ved hjælp af in vivo dyremodeller fortsætter med at være en dyr tilgang med den ekstra kompleksitet til at dechifrere en celle-autonome mekanisme fra sekundære virkninger. Udover, in vivo systemer er udfordrende at analysere CM specifikke virkninger af en farmakologisk intervention, der inducerer kardiobeskyttende signalering fra CM.
Desuden er den langsigtede kultur af voksne CMMs er nødvendig for at udføre CM spredning analyser. CM spredning assays kræver mindst 4-5 dage for celler, der skal induceres i celle cyklus og for at opnå nøjagtige data efter dette. Derudover, undersøgelser, der udnytter isolerede CMs for elektrofysiologiske undersøgelser, lægemiddelscreening, toksicitet undersøgelser, og Ca++ homøostase undersøgelser er alle behov for en forbedret kultur system5,,6,,7. Desuden viser nylige undersøgelser den kardiobeskyttende betydning af cytokiner udskilles fra CMs (cardiokines)8,9. For at undersøge den terapeutiske rolle og molekylære mekanisme af disse kardiokiner under hjerte reparation og regenerering, en langvarig kultur er påkrævet.
Voksne rotter er robuste nok til isolation af encellede celler og langsigtet kultur i et in vitro-system10,11,12. Men voksne mus CMs er af stor interesse for in vitro assays, på grund af tilgængeligheden af en række genetisk modificerede musemodeller, som giver mulighed for design og udførelse af forskellige innovative analyser, der ikke er muligt med rotte CM13. I modsætning til voksne rotte CM isolation, er det ganske udfordrende at opnå en enkelt-celle suspension fra voksne mus hjerter, og den langsigtede kultur af voksne mus CMs i kulturen er endnu mere udfordrende.
Voksen CM isolation fra mus og rotte hjerter ved hjælp af en Langendorff system er tidligere blevet etableret for at studere CMfunktion 5,14,15. Her har vi beskrevet protokollerne for voksen CM isolering fra både rotter og mus, samt en modificeret langsigtet kultur, transfektion og CM spredning af isolerede celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er et kritisk behov for at etablere en protokol for voksne kardiomyocyt isolation og langsigtet kultur til at udføre celle-specifikke mekanistiske undersøgelser. Der er kun et par rapporter diskuterer voksne CM isolation protokoller, og endnu færre af dem bruges til langsigtet kultur af voksne mus CM15,16,17. Det er blevet påvist, at den voksne rotte CM har en højere tolerance over for in vitro kultur end de voksne mus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af midler fra Institut for Patologi og Laboratoriemedicin, University of Cincinnati, College of Medicine, til Dr. Onur Kanisicak; et tilskud fra National Institutes of Health (R01HL148598) til Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak er støttet af American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117). Dr. Perwez Alam støttes af American Heart Association postdoc tilskud (AHA_20POST35200267). Dr. Malina J. Ivey støttes af et NIH T32-tilskud (HL 125204-06A1).
Materials
| 2,3-Butane Dione monoxime | Sigma-Aldrich | B-0753 | |
| Blebbistatin | APExBIO | B1387 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 449709 | |
| Cell culture plate | Corning Costar | 3526 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Cel-miR-67 | Dharmacon | CN-001000-01-50 | |
| Collagenase type2 | Worthington | LS004177 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Disposable polystyrene weighing dishes | Sigma-Aldrich | Z154881-500EA | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| EdU | Life Technologies | C10337 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-015-CV | |
| Fine Point High Precision Forceps | Fisherbrand | 22-327379 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G-5400 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | PSLAB-018285-02 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisherbrand | 12-000-128 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Light Microscope | Nikon | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Life Technologies | 13778-150 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 20012-027 | |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147-1G | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865+5G | |
| siMeis2 | Dharmacon | s161030 | |
| siRb1 | Dharmacon | s128325 | |
| Straight Blunt/SharpDissecting Scissors | Fisher Scientific | 28252 | |
| Straight Very Fine Precision Tip Forceps | Fisherbrand | 16-100-120 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158-100MG | |
| Ultra-smooth, beveled-edge finish scissor | Fisherbrand | 22-079-747 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | 3006S |
References
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12, 2233-2244 (2008).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8, 53748 (2013).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138, 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. , e50289 (2013).
- Brette, F., Orchard, C. T-tubule function in mammalian cardiac myocytes. Circulation Research. 92, 1182-1192 (2003).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34, 807-821 (2002).
- Zhou, H., et al. Exosomes in ischemic heart disease: novel carriers for bioinformation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 120, 109451 (2019).
- Wu, Y. S., Zhu, B., Luo, A. L., Yang, L., Yang, C. The Role of Cardiokines in Heart Diseases: Beneficial or Detrimental. BioMed Research International. 2018, 8207058 (2018).
- Eppenberger, H. M., Hertig, C., Eppenberger-Eberhardt, M. Adult rat cardiomyocytes in culture A model system to study the plasticity of the differentiated cardiac phenotype at the molecular and cellular levels. Trends in Cardiovascular Medicine. 4, 187-193 (1994).
- Alam, P., et al. Inhibition of Senescence-Associated Genes Rb1 and Meis2 in Adult Cardiomyocytes Results in Cell Cycle Reentry and Cardiac Repair Post-Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 8, 012089 (2019).
- Arif, M., et al. MicroRNA-210-mediated proliferation, survival, and angiogenesis promote cardiac repair post myocardial infarction in rodents. Journal of Molecular Medicine. 95, 1369-1385 (2017).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nature Cell Biology. 9, 993-999 (2007).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e56634 (2017).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. , e54012 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119, 909-920 (2016).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. , e51357 (2014).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochemistry and Biophysics. 61, 93-101 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Dou, Y., Arlock, P., Arner, A. Blebbistatin specifically inhibits actin-myosin interaction in mouse cardiac muscle. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 293, 1148-1153 (2007).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 294, 1667-1674 (2008).
- Sellin, L. C., McArdle, J. J. Multiple effects of 2,3-butanedione monoxime. Pharmacology & Toxicology. 74, 305-313 (1994).
