Vi beskriver en teknikk for profilering av microRNAs i tidlige museembryoer. Denne protokollen overvinner utfordringen med lav celleinndata og liten RNA-berikelse. Denne analysen kan brukes til å analysere endringer i miRNA-uttrykk over tid i forskjellige cellelinjer av det tidlige museembryoet.
MicroRNAs (miRNAs) er viktig for den komplekse reguleringen av celleskjebnebeslutninger og utviklingstiming. In vivo-studier av miRNAs bidrag under tidlig utvikling er teknisk utfordrende på grunn av det begrensende cellenummeret. Videre krever mange tilnærminger en miRNA av interesse for å bli definert i analyser som nordlig blotting, microarray, og qPCR. Derfor har uttrykket for mange miRNAs og deres isoformer ikke blitt studert under tidlig utvikling. Her demonstrerer vi en protokoll for små RNA-sekvensering av sorterte celler fra tidlige museembryoer for å muliggjøre relativt objektiv profilering av miRNAer i tidlige populasjoner av nevrale crestceller. Vi overvinner utfordringene med lav celleinndata og størrelsesvalg under bibliotekforberedelse ved hjelp av forsterkning og gelbasert rensing. Vi identifiserer embryonal alder som et variabelt regnskap for variasjon mellom repliker og stadium-matchet museembryoer må brukes til å nøyaktig profilere miRNAs i biologiske repliker. Våre resultater tyder på at denne metoden kan brukes bredt for å profilere uttrykket av miRNAs fra andre avstamninger av celler. Oppsummert kan denne protokollen brukes til å studere hvordan miRNAs regulerer utviklingsprogrammer i forskjellige cellelinjer av det tidlige museembryoet.
Et sentralt spørsmål om utviklingsbiologi er hvordan en enkelt udifferensiert celle kan gi opphav til en hel organisme med mange komplekse celletyper. Under embryogenese blir utviklingspotensialet til celler gradvis begrenset etter hvert som organismen utvikler seg. Et eksempel er nevrale crest avstamning, som gradvis skiller fra en multipotent cellepopulasjon til ulike terminalderivater, for eksempel perifere nevroner, glia, kranial bein og brusk. Neural crest celler er spesifisert fra ectoderm under gastrulation og deretter gjennomgå en epitel til mesenchymal overgang og migrere gjennom embryoet til diskrete steder i hele kroppen hvor de vil terminalt skille1. Tiår med arbeid har avdekket et transkripsjonelt genreguleringsnettverk, men langt mindre er kjent om mekanismene for post-transkripsjonsregulering som styrer tidspunktet for neural crest utvikling.
Tidligere arbeid tyder på at microRNAs (miRNAs) undertrykker genuttrykk for riktig utviklingstiming og celleskjebnebeslutninger2,3,4,5,6. Studier av miRNAs i neural crest utvikling har i stor grad fokusert på senere stadier av kraniofacial utvikling. For eksempel er miR-17 ~ 92 og miR-140 kritiske for palatogenesis under kraniofacial utvikling i mus og sebrafisk,henholdsvis 7,8. Bidraget fra miRNAs til de tidligste nevrale crest skjebne beslutninger av embryoet har ikke blitt grundig undersøkt. Studier av miRNAs i tidlige skjebnebeslutninger har vært begrenset av tekniske utfordringer som det lave cellenummeret som finnes i tidlige embryoer.
MiRNAs har blitt profilert in vitro fra cellelinjer ved hjelp av embryolegemer på forskjellige stadier av differensiering for å modellere tidlig museutvikling9. Undersøkelsen av små RNA-er in vivo under tidlig pattedyrutvikling har vært relativt begrenset. Tidligere metoder for å profilere miRNAs har ført til skjevhet som en kjent sekvens brukes til å analysere uttrykk for en bestemt miRNA i metoder som qPCR, microarrays, og nordlige flekker10. Neste generasjons sekvensering og stadig bedre molekylære verktøy gjør det nå mulig for relativt objektiv analyse av miRNA-uttrykk for å studere deres bidrag til tidlig pattedyrutvikling og celleskjebnebeslutninger.
Her rapporterer vi en teknikk for å høste og sekvensere små RNA-er uttrykt i nevrale crestceller fra tidlige museembryoer som spenner over gastrulation (E7.5) til begynnelsen av organogenese (E9.5). Denne teknikken er enkel og kombinerer avstamning sporing, celle sortering, og gel-basert størrelse valg for å forberede små RNA sekvensering biblioteker fra et minimalt antall celler for neste generasjon sekvensering. Vi understreker viktigheten av streng somite stadium matching av embryoer for å løse 6-timers tidsintervaller for å få et omfattende syn på miRNAs under de raske endringene i tidlig utvikling. Denne metoden kan brukes mye på genetiske og utviklingsstudier og unngår pooling av embryoer. Vi beskriver en måte å overvinne utfordringer med nåværende metoder som miRNA-berikelse ved hjelp av gelbasert rensing, bibliotekkvantifisering og minimere skjevhet introdusert fra PCR. Denne metoden har blitt brukt til å identifisere miRNA uttrykksmønstre over tid for å studere hvordan miRNAs kontrollere utviklingstiming i neural crest avstamning av museembryoer.
Utviklingsprosesser kan fortsette raskt, og celler gjennomgår mange sekvensielle spesifikasjoner slik at for å fange en omfattende visning av miRNAs bidra til tidlige skjebnebeslutninger, er det nødvendig med mer spesifikk iscenesettelse enn den mye brukte halvdagsøkningen. En fersk studie har utført RNA sekvensering fra Theiler stadium 12 embryoer som spenner fra å ha 3 til 6 somites11. Vi finner at i løpet av denne perioden er nevrale crest-cellene spesifisert (3 somites av alder), delaminate (4 somites of age), og migrere (5-6 somites av alder). Vi finner også at i tillegg til Cre-driveren som brukes til avstamning sporcellepopulasjoner, alder er den største kilden til variasjon mellom biologiske prøver, og bare somite matchet embryoer bør betraktes som replikerer. Dette bør også tas i betraktning ved sammenligning av transgene embryoer med wildtype kontroller.
Tidligere metoder for å profilere miRNAs under tidlig utvikling har brukt mellom 10-100 ng av RNA-inngang for små RNA sekvensering bibliotek forberedelse og har samlet flere embryoer i en prøve13,14. Vi demonstrerer RNA-isolasjon og bibliotekforberedelse fra et enkelt E7.5-embryo eller fra sorterte nevrale crestceller på E8,5 og E9,5 ved hjelp av ca. 100 ng av totalt RNA som inngang. Når de dissosierer embryoer for sortering, bør man passe på å se dissosiasjonen under et mikroskop og slukke reaksjonen for å observere når enkeltceller oppnås. Vi finner at dissosiasjon av kranialregionen E8.5-E9.5 embryoer er nesten umiddelbar med mild manuell pipettering som beskrevet i protokollen. For større vev og stadig eldre embryoer kan dissosiasjonstiden være lengre avhengig av hvilken del av embryoet som blir dissosiert. For E7.5-E9.5 embryoer er klumper av celler lett synlige under mikroskopet, og dissosiasjonen skal fortsette til det ikke er flere klumper er synlige. Enkeltceller er synlige i løsningen hvis du justerer fokuset gjennom løsningen i brønnen din alt fra 5-10x. Tidligere metoder sorterer celler direkte inn i lysisbuffer for RNA-sekvensering for å forberede bulk RNA fra et lavt antall celler14. Her sorterer vi direkte inn i RNA utvinning lysis løsning slik at RNA kan isoleres før starten av biblioteket forberedelse. Bruk av minikolonner med 11 μL elutionvolum tillatt for en høy nok RNA-konsentrasjon slik at en enkelt RNA-prep kan deles mellom liten RNA og bulk RNA-sekvensering.
En nåværende begrensning av de fleste små RNA sekvensering metoder er PCR forsterkning av konvertert cDNA. Vår metode overvinner ikke denne begrensningen, men vi var i stand til å minimere antall PCR sykluser fra 25-maksimum anbefalt ned til 16 sykluser. Denne reduksjonen i forsterkning reduserer kunstig forsterkningsbias introdusert av PCR. En annen kilde til bias er ligation av adaptere, hvor det er kjent at bestemte sekvenser som ligger i endene av adaptere og miRNAs kan ligate sammen med større effektivitet enn andre sekvenser. For å unngå dette har adapterne som brukes i denne protokollen 4 tilfeldige baser innlemmet på slutten av hver adapter for å forhindre skjevhet i ligation reaksjoner. I tillegg er et annet vanlig problem mengden av kort dimers som danner når RNA-inndataene er lav. Bibliotekets forberedelsessett inkluderer trinn for å redusere adapterduserdannelse som adapteraktivering og perleopprydding for å fjerne overflødige adaptere etter hver ligation. Vi fortynnet også 3′ og 5′ 4N-adaptere med 1/4 for å redusere mengden adapterduser som kan dannes. Vi fant ut at når den ikke fortynnes, øker 130 bp-båndintensiteten, noe som gjør det vanskelig å skille fra 150 bp-båndet som inneholder de ønskede små RNA-bibliotekene på en gel.
En annen aktuell utfordring med å forberede sekvenseringsbiblioteker er nøyaktig kvantifisering av produktet før sekvensering. Vi har funnet ut at ulike metoder gir varierende resultater på samme bibliotek. Vi foreslår at forskerne bruker flere kvantifiseringsmetoder for å få en nøyaktig estimering av konsentrasjon.
Denne protokollen kan brukes mye på genetiske, utviklingsstudier eller andre anvendelser der RNA høstes fra et lavt antall celler. Denne tilnærmingen forenkler timelige studier ved å unngå pooling av embryoer og kan enkelt brukes på både ikke-sorterte og sorterte celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet av Andrew McDonough B + Foundation og NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. er en CPRIT Scholar in Cancer Research (RR150106) og V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Forfatterne ønsker også å anerkjenne Cytometry og Cell Sorting Core på BCM for å gi utstyr som er nødvendig for dette prosjektet.
#5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |