High-Throughput Methode voor het meten van alcohol sedatie tijd van individuele Drosophila melanogaster

Summary

De huidige methoden om de alcoholgevoeligheid in Drosophila te meten zijn ontworpen om groepen vliegen te testen. We presenteren een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De methode vereist geen gespecialiseerde gereedschappen en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen.

Abstract

Drosophila melanogaster biedt een uitstekend model om de genetische onderbouwing van alcoholgevoeligheid te bestuderen. In tegenstelling tot studies bij menselijke populaties, het Drosophila model maakt strikte controle over de genetische achtergrond, en vrijwel onbeperkt aantal individuen van hetzelfde genotype kan snel worden opgevoed onder goed gecontroleerde omgevingsomstandigheden zonder wettelijke beperkingen en tegen relatief lage kosten. Vliegen blootgesteld aan ethanol ondergaan fysiologische en gedragsveranderingen die lijken op menselijke alcohol intoxicatie, met inbegrip van verlies van posturale controle, sedatie, en de ontwikkeling van tolerantie. Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor het beoordelen van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen. De test is gebaseerd op video-opname van enkele vliegen geïntroduceerd zonder verdoving in 24-well cel cultuur platen in een set-up die synchrone initiatie van blootstelling aan alcohol mogelijk maakt. Het systeem stelt een enkele persoon in staat om individuele ethanol sedatiegegevens te verzamelen over maar liefst 2.000 vliegen binnen een werkperiode van 8 uur. De test kan in principe worden uitgebreid om de effecten van blootstelling aan vluchtige stoffen te beoordelen en toegepast worden op het meten van effecten van acute toxiciteit van vluchtige stoffen op andere insecten, waaronder andere vliegsoorten.

Introduction

Het National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism meldt dat in 2015 overmatig alcoholgebruik, aangeduid als "alcoholgebruik stoornis", getroffen naar schatting 16 miljoen mensen in de Verenigde Staten. Alcoholmisbruik veroorzaakt een breed scala van nadelige fysiologische effecten en is een belangrijke doodsoorzaak in de VS. Bij de mens heeft een verminderde gevoeligheid, of een lage respons op alcohol, een sterke genetische component en wordt geassocieerd met een hoger risico op het ontwikkelen van alcoholgebruiksstoornissen^1,2,3,4. Genetische risicostudies op menselijke populaties zijn uitdagend vanwege populatievermenging, diverse ontwikkelingsgeschiedenissen en blootstelling aan het milieu, en afhankelijkheid van zelfgerapporteerde vragenlijsten om alcoholgerelateerde fenotypen te kwantificeren, die vaak verward zijn met andere neuropsychiatrische aandoeningen.

Drosophila melanogaster biedt een uitstekend model om de genetische onderbouwing van alcoholgevoeligheid^5,6,7,8te bestuderen. Het Drosophila-model maakt strikte controle over de genetische achtergrond mogelijk, en vrijwel onbeperkte aantallen individuen van hetzelfde genotype kunnen snel worden gefokt onder goed gecontroleerde omgevingsomstandigheden zonder wettelijke beperkingen en tegen relatief lage kosten. Naast openbaar beschikbare mutaties en RNAi-lijnen die gericht zijn op een meerderheid van de genen in het genoom, heeft de beschikbaarheid van het Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP), een populatie van 205 ingeteelde wild afgeleide lijnen met volledige genoomsequenties, genoombrede associatiestudies^9,10mogelijk gemaakt. Dergelijke studies hebben genetische netwerken geïdentificeerd die verband houden met effecten op de ontwikkelingstijd en levensvatbaarheid bij blootstelling aan ethanol^11,12. Evolutionaire conservering van fundamentele biologische processen maakt het mogelijk translationele conclusies te trekken door het overplaatsen van menselijke orthologs op hun vlieg tegenhangers.

Vliegen blootgesteld aan ethanol ondergaan fysiologische en gedragsveranderingen die lijken op menselijke alcoholintoxicatie, met inbegrip van verlies van posturale controle⁸, sedatie, en ontwikkeling van tolerantie^13,14,15. Alcohol geïnduceerde sedatie in Drosophila kan worden gekwantificeerd met behulp van inebriometers. Dit zijn 122 cm lange verticale glazen kolommen met schuine mazen waar vliegen^16,17,18aan kunnen bevestigen . Een groep van ten minste 50 vliegen (geslachten kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd) worden geïntroduceerd in de bovenkant van de kolom en blootgesteld aan ethanol dampen. Vliegen die posturale controle verliezen vallen door de kolom en worden verzameld met intervallen van 1 minuten. De gemiddelde elutietijd dient als een maat voor de gevoeligheid voor alcoholintoxicatie. Wanneer vliegen een tweede keer na herstel van de eerste blootstelling aan alcohol worden blootgesteld, kunnen ze tolerantie ontwikkelen, zoals blijkt uit een verschuiving in gemiddelde elutietijd^13,15,19,20. Overwegende dat inebriometer testen hebben geleid tot de identificatie van genen, genetische netwerken, en cellulaire trajecten in verband met alcohol sedatie gevoeligheid en de ontwikkeling van tolerantie^12,13,14,21, de test is tijdrovend, lage doorvoer, en ineffectief voor het meten van alcohol gevoeligheid in enkele vliegen.

Alternatieve ethanol sedatie tests die niet nodig de uitgebreide inebriometer set-up zorgen voor meer handige metingen, maar zijn nog steeds beperkt in doorvoer en in het algemeen vereisen analyses van groepen vliegen in plaats van individuen^{21,22,23,24,25}. Het beoordelen van enkele vliegen minimaliseert de kans op verstorende effecten als gevolg van groepsinteracties, zoals die welke voortvloeien uit sociaal gedrag. Hier presenteren we een eenvoudige, goedkope, hoge doorvoer test voor de beoordeling van alcohol sedatie gevoeligheid in grote aantallen enkele vliegen.

Protocol

1. Bouw van het testapparaat

1. Maak een kartonnen sjabloon ter grootte van een 24-well cel kweekplaat door het traceren van rond de plaat op karton en het uitsnijden van de aangewezen gebied.
2. Snijd een stuk klein insectenscherm gaas de grootte van de cel cultuurplaat met behulp van de kartonnen sjabloon van stap 1.1.
3. Bereid een 24-well cel cultuurplaat door het plaatsen van een kleine lijn van hete lijm rond de omtrek van de bovenkant van de plaat met behulp van een hete lijm pistool en het aanbrengen van het scherm gaas op de top van de open putten.
4. Zet een houten ambachtelijke stok aan elk van de drie zijden van dezelfde cel cultuurplaat van stap 1.3 met behulp van een hete lijm pistool. De gewijzigde celkweekplaat moet nu lijken op het plaatdiagram in figuur 1A en de experimentele opstelling in figuur 2.
   LET OP: Bereid minstens zoveel celkweekplaten voor als in de filmkamers past (zie hieronder).

Figuur 1: Diagram van het testapparaat en de filmkamer. (A) Bovenste diagrammen. De boven-, zij- en vooraanzicht van het testapparaat worden respectievelijk weergegeven. Een scherm gaas ligt plat op de top van een 24-well cel cultuur plaat. De houten ambachtelijke stokken, vertegenwoordigd door de pijlpunten, zijn bevestigd aan drie aangrenzende zijden voor stabiliteit en uitlijning steun, twee aan de zijkant van de put plaat met zes putten en een aan de zijkant van de plaat met vier putten. Alle hulpstukken zijn heet gelijmd op het apparaat. bB) lagere diagrammen. De boven-, zij- en vooraanweergaven van de testopstelling worden respectievelijk weergegeven. Een spleet wordt gesneden in de rechterkant van de doos, van de opening voor het deksel aan de achterkant van de opening, met de onderkant van de spleet niveau aan het binnenoppervlak. Het gat op de bovenkant van de doos, het oppervlak parallel aan de grond, is gecentreerd voor maximale videobelichting. De gearceerde doos vertegenwoordigt de videocamera. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2: Foto van het testsysteem. De videocamera wordt geplaatst op de top van de polystyreen kamer, met de lens ingevoegd in de cut-out gat, geïllustreerd in de diagrammen van figuur 1B. Twee sets van gemodificeerde 24-well cel cultuur platen rusten op de top van een verlichting pad dat wordt ingevoegd in een spleet door de zijkant van de kamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

2. Bouw van de filmkamer

1. Maak een filmkamer door een gat te maken ter grootte van de videocameralens aan de zijkant van een polystyreendoos. Snijd een extra spleet de breedte van het verlichtingspad in de andere kant van de polystyreen doos. De filmkamer moet lijken op de filmkamer getoond in figuur 1B en figuur 2.
2. Bereid de filmkamer voor op gebruik door het verlichtingspad in de gleuf te plaatsen en de camera in het lensgat boven het verlichtingspad te plaatsen.
3. Plaats alle materialen en voer alle daaropvolgende tests uit in een gecontroleerde omgeving, bij voorkeur een gedragskamer met ongeveer 30% vochtigheid, 25 °C temperatuur, uniforme luchtstroom en geluidsniveaus van minder dan 65 dB.

3. Bereiding van het testapparaat en de vliegen

1. Pipetteer 1 mL van 100% ethanol door het scherm gaas in elke put.
2. Droog het scherm gaas met een stuk kaasdoek.
3. Snijd twee stukken kaasdoek de afmetingen van de cel cultuurplaat met behulp van de kartonnen sjabloon gemaakt in stap 1.1. Leg ze op de bovenkant van het droge scherm gaas van de gemodificeerde cel kweekplaat met ethanol uit stap 3.2.
4. Maak een klein stukje dunne, flexibele kunststof snijplank door het traceren van rond de kartonnen sjabloon gemaakt in stap 1.1 als een algemene gids en het uitbreiden van de getraceerde gebied met 1-2 cm aan een van de korte zijden. Knip het uitgebreide getraceerde gebied uit de dunne, flexibele kunststof snijplank. Zorg er na het snijden voor dat het plastic nog steeds tussen de drie houten ambachtelijke stokken op het testapparaat past, maar hangt aan één uiteinde met 1-2 cm.
5. (Optioneel) Als een aspirator moet worden gemaakt, monteer dan een aspirator zoals die in figuur 3 door eerst een P1000 pipetpunt doormidden te snijden. Steek het stuk met een grotere diameter in een uiteinde van een ~ 30 cm stuk flexibele slang om te dienen als een mondstuk.

Figuur 3: Een vliegaspirator waarin vliegen worden verzameld met een verwisselbaar mondstuk bevestigd aan flexibele buizen en een brede boring serologische pipet met een katoenen gaas . De operator kan een enkele vlieg in de pipet aanzuigen voor overdracht zonder verdoving. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6. (Optioneel) Om de aspirator assemblage te voltooien, bedek het brede uiteinde van een 10 cm stuk serologische pipet met gaas om te voorkomen dat vliegen in de slang komen en de pipet, gaas eerst, in het open uiteinde van de slang om te dienen als een vliegkamer. De aspirator moet lijken op die in figuur 3.
7. Met behulp van een aspirator (Figuur 3, stappen 3.5 en 3.6), aanzuigen een vlieg per goed in een aparte 24-well cel cultuur plaat. Gebruik het flexibele plastic om alle putten met eerder aangezogen vliegen te bedekken. Noteer de putpositie en alle relevante genotype- of fenotype-informatie van elke vlieg.
8. Houd de flexibele kunststof flush met de bovenkant van de cel cultuurplaat met de vliegen om hun ontsnapping te voorkomen en omkeren van de plaat op de bovenkant van de gewijzigde cel cultuurplaat met de ethanol. Het vel flexibel plastic moet rusten op de top van de vellen kaasdoek. Lijn de omgekeerde celcultuurplaat met vliegen met behulp van de ambachtelijke stokken om ervoor te zorgen dat elk goed met ethanol uitgelijnd met elke put met een vlieg.
9. De experimentele opstelling moet lijken op figuur 2.

4. Het testen van de vliegen

1. Zorg ervoor dat het verlichtingspad op volle helderheid brandt voor maximaal visueel contrast. Begin met opnemen met de videocamera.
2. Om de vliegen bloot te stellen aan ethanol, verwijder voorzichtig het plastic tussen de putplaat en het testapparaat, waarbij u ervoor zorgt dat de kaasdoek niet wordt losgemaakt.
3. Beëindig de video-opname zodra alle vliegen de controle hebben verloren. Zodra het vermoeden bestaat dat alle vliegen de posturale controle hebben verloren, tikt u stevig in het midden van de plaat om ervoor te zorgen dat alle vliegen volledig verlies van posturale controle hebben. Als er beweging is, blijf dan opnemen. Blijf periodiek tikken (elke 1-2 min) totdat er geen beweging optreedt.
4. (Optioneel) Om de vliegen snel terug te krijgen, verwijder je alleen de bovenste plaat uit het testapparaat, waaruit blijkt dat er verdoofde vliegen op de kaasdoek rusten. Aanzuigen individuele vliegt in gekozen containers voor herstel.
5. Vervang de ethanol in de gemodificeerde celkweekplaten door 1 mL verse 100% ethanol ten minste 1x per uur om te controleren op verdamping en bevochtiging van de ethanol en om consistente blootstelling aan ethanol gedurende de hele test te behouden. Droog het scherm gaas met kaasdoek.
6. Herhaal dit voor zoveel monsters als gewenst.
   OPMERKING: Voor de hoogste doorvoer, aanzuigen de volgende ronde van vliegen in nieuwe cel cultuur platen tijdens de video-opname. Het protocol kan hier worden onderbroken, omdat de video-opname later kan worden beoordeeld.

5. Bepaling van de sedatietijd van vliegen

1. Neem sedatietijd op voor elke individuele vlieg door de video-opname te bekijken. Sedatie tijd wordt gedefinieerd als het moment dat een vlieg verliest volledige posturale controle en motorische vermogen. Het wordt aanbevolen om de film in omgekeerde richting te bekijken en de tijd op te nemen dat de vlieg begint te bewegen om de nauwkeurigheid te garanderen.

Results

Twee 24-well microtiter platen kunnen gelijktijdig gegevens genereren op 48 individuele vliegen binnen slechts 10 min. Tabel 1 bevat metingen van ethanol sedatietijden voor 48 individuele vliegen, mannen en vrouwen afzonderlijk, van twee DGRP lijnen met verschillende gevoeligheden voor blootstelling aan alcohol op ontwikkelingstijd en levensvatbaarheid¹³. De RAL_555 waren minder gevoelig dan lijn RAL_177 (figuur 4, tabel 2; p < 0,0001, ANOVA). Mannetjes en vrouwtjes van RAL_177 vertoonden geen seksueel dimorphic effect (Figuur 4, Tabel 2; p > 0.1, ANOVA), overwegende dat vrouwtjes van lijn RAL_555 minder gevoelig waren voor blootstelling aan ethanol dan de mannetjes ( Figuur4, Tabel 2; p < 0,006, ANOVA). Het grote aantal vliegen dat tegelijkertijd kan worden gemeten en de mogelijkheid om geslachten en verschillende lijnen gelijktijdig te meten kan de nauwkeurigheid verhogen door fouten te verminderen als gevolg van omgevingsvariatie.

A.	Ethanol Sedation Time (s)						B.	Ethanol Sedation Time (s)
	Vrouwen			Mannen				Vrouwen			Mannen
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

Tabel 1: Metingen van ethanolsedatietijden (s) van individuele vliegen van (A) DGRP-lijnen RAL_177 en (B) RAL_555 voor afzonderlijke geslachten (n = 48). Zie ook tabel 2, figuur 4.

Figuur 4: De sedatietijden van alcohol van DGRP-lijnen RAL_177 en RAL_555. De staven vertegenwoordigen middelen en de foutstaven SEM (n = 48). Sedatietijden voor RAL_177 vliegen waren minder dan die voor RAL_55 vliegen (p < 0,0001, ANOVA). Individuele gegevenspunten zijn vermeld in tabel 1. Aanvullende statistisch significante verschillen tussen geslachten en regels zijn aangegeven in de tekst en in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Analyse	Bron van variatie	Df	Ss	F-Waarde	P-waarde
Volledig model samengevoegd	Lijn	1	769627	34.869	<0,0001
	Sex	1	105001	4.757	0.0304
	Lijn x Seks	1	86021	3.897	0.0498
	Fout	188	4149491
Gereduceerd model vrouwen	Lijn	1	685126	23.58	<0,0001
	Fout	94	2730718
Gereduceerd model mannen	Lijn	1	170522	11.3	0.0011
	Fout	94	1418774
Minder model RAL_177	Sex	1	473	0.023	0.8800
	Fout	94	1943741
Minder model RAL_555	Sex	1	190549	8.12	0.0054
	Fout	94	2205751

Tabel 2: Analyses van variantie voor sedatietijd over geslacht en DGRP-lijn. Het gebruikte model was Y = μ + L + S + LxS + ε, waarbij μ het algemene gemiddelde is, L het vaste effect is van de DGRP-lijn (RAL_177, RAL_555), S is het vaste effect van geslacht (mannelijk, vrouwelijk), LxS is de interactieterm (vast), en ε is de foutterm. De modellen Y = μ + L + ε en Y = μ + S + ε werden gebruikt voor de gereduceerde modellen. Line, Sex en de Line x Sex interactie term waren allemaal significant in het volledige model op α < 0,05. Verminderde modellen door geslacht en DGRP lijn RAL_555 waren ook significant bij α < 0.01. Zie ook tabel 1, figuur 4. df = vrijheidsgraden, SS = Type I Sommen vierkanten.

Discussion

Hier presenteren we een eenvoudige, goedkope en hoge doorvoer methode voor het beoordelen van sedatie tijd als gevolg van blootstelling aan ethanol in Drosophila melanogaster. In tegenstelling tot veel huidige methoden, waarvoor groepsanalyses nodig zijn, stelt deze test een enkele persoon in staat om individuele sedatietijdgegevens te verzamelen voor ~ 2.000 vliegen binnen een werkperiode van 8 uur. We vonden dat een enkele persoon kan scoren 48 vliegen voor sedatie tijd in ongeveer 5 min. In dit tempo kunnen 2.000 vliegen worden gescoord in ongeveer 4 uur, hoewel scoren later kan worden uitgevoerd. Met onze test varieert de geregistreerde sedatietijd voor de meeste vliegen van 5-15 min bij blootstelling aan 1 mL van 100% ethanol. Lagere concentraties ethanol of kleinere leveringsvolumes zullen resulteren in langere sedatietijden.

De huidige methoden voor de beoordeling van de sedatietijd vereisen het testen van grote aantallen vliegen zonder metingen op alleenstaanden^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}. Veel huidige sedatie en gevoeligheidstesten zijn afhankelijk van ST50^22,23,24, het tijdstip waarop 50% van de vliegen wordt verdoofd als gevolg van blootstelling aan ethanol. Hoewel het verkrijgen van de ST50 voor groepen vliegen niet de primaire motivatie was om deze test te ontwikkelen, tonen de video-opnamen een hoger nut aan in vergelijking met de huidige methoden, omdat de opnames kunnen worden gebruikt om de ST50 vast te stellen voor groepen individueel geteste vliegen en om het percentage vliegen te meten dat aan een bepaald criterium voldoet (bijvoorbeeld verlies van posturale controle) op elk moment. Opgemerkt moet worden dat dergelijke video-analyses extra tijd zouden vergen.

In tegenstelling tot de huidige inebriometer testen, de methode die we beschrijven vereist geen gespecialiseerde tools op te zetten en kan worden uitgevoerd in elk laboratorium met behulp van gemeenschappelijke materialen. Met behulp van deze methode hebben we betrouwbare en consistente sedatietijden voor individuele vliegen verkregen. De test kan in beginsel worden uitgebreid om de effecten van blootstelling aan vluchtige stoffen te beoordelen. De test kan ook worden toegepast om effecten van acute toxiciteit van vluchtige stoffen op andere insecten, waaronder andere vliegsoorten, te meten. Individuele sedatietijdgegevens kunnen worden gebruikt om de mate van fenotypische variatie binnen een populatie, zoals de DGRP, te beoordelen.

We gebruikten kleine insectenzeefnetjes om direct contact met de ethanoloplossing te voorkomen, terwijl we voldoende hoeveelheden ethanoldampen de vlieg konden bereiken. De laag witte kaasdoek op de top van het scherm mesh biedt visueel contrast tussen de vlieg en het oppervlak hieronder en zorgt ervoor dat vliegen niet verstrikt raken in het scherm mesh, wat kan leiden tot dubbelzinnige bepaling van het verlies van posturale controle. Commercieel verkrijgbare membranen die poreus zijn voor water en lucht gaven inconsistente resultaten en waren onvoldoende doordringbaar voor ethanoldampen. We hebben bewust gebruik gemaakt van kleine insect scherm gaas, omdat het een uniform poreus materiaal dat variatie in ethanol blootstelling minimaliseert als gevolg van vlieg positie binnen een put. Wijzigingen kunnen worden aangebracht in dit protocol op basis van beschikbare materialen, hoewel we raden een gecontroleerde gedragskamer, toegang tot 90%-100% ethanol dicht bij de vlieg, en uniforme ethanol blootstelling.

Vlieg positie binnen de cel cultuur platen moeten worden gerandomiseerd tussen repliceert om positionele bias te voorkomen. Voor grotere experimenten die gebruik van deze test over meerdere dagen vereisen en daarom onderhevig zijn aan omgevingsvariatie die de resultaten van de test kan beïnvloeden (bijvoorbeeld veranderingen in de barometerdruk)^27,raden we ten zeerste aan dat vliegen elke dag op hetzelfde tijdstip worden getest en gerandomiseerd, zowel binnen als over dagen, vooral als verschillende lijnen en/of geslachten met elkaar moeten worden vergeleken.

De methode die we hebben ontwikkeld is het meest geschikt voor het meten van het effect van acute blootstelling aan alcohol, maar is niet geschikt voor het verkrijgen van consumptiegegevens of modelleringsverslaving. Gegevens over de gevoeligheid van alcoholsedatie die uit deze test zijn verkregen, kunnen echter worden geïntegreerd met andere maatregelen van alcoholgerelateerde fenotypen. Een beperking van het systeem is dat de verticale hoogte van standaard celcultuurplaten verticale vliegbewegingen mogelijk maakt die niet gemakkelijk door video kunnen worden gevolgd voor een gedetailleerde beoordeling van de algehele activiteit of bewegingsvrijheid. Deze beperking heeft echter geen invloed op een nauwkeurige beoordeling van de sedatietijd. Bij het gebruik van vliegen van verschillende genotypen (bijvoorbeeld in DGRP-afgeleide uitgefokte populaties²⁸), maakt deze test het ook mogelijk om individuele vliegen op te halen om zwembaden van vliegen te verzamelen met contrasterende fenotypes voor bulk DNA-sequencing en extreme QTL mapping^29,30. Globaal, staat deze test snelle, goedkope inzameling van de gegevens van de alcoholsedatie op grote aantallen enige vliegen toe.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well Cell Culture Plates	Corning	3526	Flat-bottomed; will house flies throughout assay
Aspirator
Cheesecloth	Genesee Scientific	53-100	Widely available.
Ethanol	Decon Labs	V1001	Widely available.
Flexible Plastic Cutting Board (Plate Cover)	Walmart	550098612	Any flat plastic that can slide easily and cover a 24-well plate completely. Flexible plastic cutting board works well.
Gauze (for aspirator)	Honeywell North	67622	Widely available.
Illumination Pad	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	Any light pad to provide contrast is suitable.
Jumbo Craft Sticks	Michaels	10334892	Any craft stick at least 7 cm long is suitable.
P1000 Pipette Tip (for aspirator)	Genesee Scientific	24-165RL	Any P1000 pipette tip is suitable.
Serological Pipette (for aspirator)	Genesee Scientific	12-104
Small Insect Screen Mesh	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	Any small insect screen mesh is suitable.
Testing Chamber			Interior space dimension big enough to encompass light pad. Can be constructed from a polystyrene box.
Tygon Tubing (for aspirator)	Grainger	9CUG7	Widely available.
Video Camera	Canon	1959C001AA	Any video camera is suitable.