Mouse Footpad Inokulasjon Modell for å studere viral-indusert neuroinflammatoriske responser
Summary
Fotputeinokulasjonsmodellen er et verdifullt verktøy for å karakterisere virusinduserte nevroinflammatoriske responser in vivo. Spesielt gir det en klar vurdering av viral kinetikk og tilhørende immunopathological prosesser initiert i det perifere nervesystemet.
Abstract
Denne protokollen beskriver en fotputeinokulasjonsmodell som brukes til å studere initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon hos mus. Som alfaherpesvirus er hovedinntrengere i det perifere nervesystemet (PNS), er denne modellen egnet til å karakterisere kinetikkene til viral replikering, spredning fra PNS til CNS, og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen gjør at viruspartikler kan spre seg fra et primært infeksjonssted i fotputeeeepidermis til sensoriske og sympatiske nervefibre som innervate epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg via isjiasnerven til dorsale rotgangene (DRG) og til slutt gjennom ryggmargen til hjernen. Her er en musefotpute inokulert med pseudorabies virus (PRV), et alfaherpesvirus nært relatert til herpes simplex virus (HSV) og varicella-zoster virus (VZV). Denne modellen viser at PRV-infeksjon induserer alvorlig betennelse, preget av nøytrofil infiltrasjon i fotblokken og DRG. Høye konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner oppdages senere i homogenisert vev av ELISA. I tillegg observeres en sterk korrelasjon mellom PRV-gen- og proteinuttrykk (via qPCR og IF-farging) i DRG og produksjon av proinflammatoriske cytokiner. Derfor gir fotputeinokulasjonsmodellen en bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier og kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. I tillegg kan modellen veilede forskning på perifere nevropatier, for eksempel multippel sklerose og tilhørende virusindusert skade på PNS. Til syvende og sist kan det tjene som et kostnadseffektivt in vivo-verktøy for narkotikautvikling.
Introduction
Denne studien beskriver en fotputeinokulasjonsmodell for å undersøke replikering og spredning av virus fra PNS til CNS og tilhørende nevroinflammatoriske responser. Footpad inokulasjonsmodellen har blitt intensivt brukt til å studere alfaherpesvirusinfeksjon i nevroner1,,2,3. Hovedmålet med denne modellen er å tillate nevrotropiske virus å reise en maksimal avstand gjennom PNS før du når CNS. Her brukes denne modellen til å få ny innsikt i utviklingen av en bestemt nevropati (nevropatisk kløe) hos mus infisert med pseudorabies virus (PRV).
PRV er et alfaherpesvirus relatert til flere kjente patogener (dvs. herpes simplex type 1 og 2 [HSV1 og HSV2] og varicella-zoster virus [VZV]), som forårsaker forkjølelsessår, genital lesjoner og kylling pox, henholdsvis4. Disse virusene er alle pantropiske og i stand til å infisere mange forskjellige celletyper uten å vise affinitet for en bestemt vevstype. Imidlertid viser de alle en karakteristisk nevrotropisme ved å invadere PNS (og av og til CNS) av vertsarter. Den naturlige verten er grisen, men PRV kan infisere de fleste pattedyr. I disse ikke-naturlige vertene smitter PRV PNS og induserer en alvorlig kløe kalt “mad itch”, etterfulgt av perakutt død5,6. Rollen til nevroimmun respons i det kliniske utfallet og patogenesen av PRV-infeksjon har blitt dårlig forstått.
Fotputeinokulasjonsmodellen gjør det mulig for PRV å starte infeksjon i fotputens epidermale celler. Deretter sprer infeksjonen seg inn i sensoriske og sympatiske nervefibre som innerverer epidermis, svettekjertler og dermis. Infeksjonen sprer seg av viruspartikler som beveger seg via isjiasnerven til DRG innen ca. 60 timer. Infeksjonen sprer seg gjennom ryggmargen, og når til slutt bakhjernen når dyr blir moribund (82 t etter infeksjon). I løpet av dette tidsvinduet kan vevsprøver samles inn, behandles og analyseres for virusreplikering og markører for immunresponsen. For eksempel kan histologisk undersøkelse og virusbelastning kvantifisering utføres i forskjellige vev for å etablere sammenhenger mellom initiering og utvikling av kliniske, virologiske og nevroinflammatoriske prosesser i PRV patogenese.
Ved hjelp av fotputeinkulasjonsmodellen kan de cellulære og molekylære mekanismene til PRV-indusert kløe hos mus undersøkes. Videre kan denne modellen gi ny innsikt i initiering og utvikling av virusinflammation under herpesvirusinfeksjoner. En bedre forståelse av prosessene underliggende alfaherpesvirus-induserte nevropatier kan føre til utvikling av innovative terapeutiske strategier. For eksempel er denne modellen nyttig å undersøke mekanismene for nevropatisk kløe hos pasienter med post-herpetic lesjoner (f.eks herpes zoster, helvetesild) og teste nye terapeutiske mål hos mus for tilsvarende menneskelige sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotputeinokulasjonsmodellen som er beskrevet her, er nyttig for å undersøke initiering og utvikling av nevroinflammatoriske responser under alfaherpesvirusinfeksjon. Videre brukes denne in vivo-modellen til å etablere kinetikk av replikering og spredning av alfaherpesvirus fra PNS til CNS. Dette er et alternativ til andre inokulasjonsmodeller, for eksempel flankehudinokulasjonsmodellen, som er avhengig av dyp dermal riper13, eller intrakraniell rute, som direkte introduserer viruset i CNS<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Charles laboratorier for deres utmerkede tekniske støtte som utfører histopatologianalyser. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (RO1 NS033506 og RO1 NS060699). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
- Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
- Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
- Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
- Wittmann, G., Rziha, H. J., Knipe, D. M., Howley, P. M. Aujeszky’s disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. 9, 230-325 (1989).
- Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. . Diseases of swine, 6th ed. , 209-223 (1986).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer’s Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608 (2017).
- Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
- Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087 (2019).
- Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
- Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
- Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
- Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
- Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), 364-382 (2013).
- Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
- MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188 (2018).
- Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
- Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), 49 (2017).
- Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).
