ウイルス誘導神経炎症反応を研究するマウスフットパッド接種モデル
Summary
フットパッド接種モデルは、生体内でウイルス誘発性神経炎症反応を特徴付けるための貴重なツールです。特に、末梢神経系において開始されたウイルス動態および関連する免疫病理学的プロセスの明確な評価を提供する。
Abstract
このプロトコルは、マウスにおけるαヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を研究するために使用されるフットパッド接種モデルを記述する。αヘルペスウイルスは末梢神経系(PNS)の主な侵略者であるため、このモデルは、ウイルス複製の運動、PNSからCNSへの広がり、および関連する神経炎症反応を特徴付けるために適している。フットパッド接種モデルにより、ウイルス粒子は、フットパッド表皮の一次感染部位から、表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維および交感神経線維に広がる。感染は坐骨神経を介して後頭根神経節(DRG)に広がり、最終的には脊髄を介して脳に広がる。ここでは、マウスフットパッドに、シュードラビウイルス(PRV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)および水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)と密接に関連するアルファヘルペスウイルスを接種する。このモデルは、PRV感染がフットパッドおよびDRGにおける好中球浸潤を特徴とする重度の炎症を誘発することを示す。高濃度の炎症性サイトカインは、ELISAによってホモジナイズ組織で続いて検出される。また、DRGにおけるPRV遺伝子とタンパク質発現(qPCRおよびIF染色による)と炎症性サイトカインの産生との間には強い相関関係が認められる。したがって、フットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス誘導神経障害の基礎となるプロセスをよりよく理解し、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。さらに、このモデルは、多発性硬化症およびPNSに関連するウイルス誘発損傷などの末梢神経障害に関する研究を導くことができる。最終的には、医薬品開発のための費用対効果の高いインビボツールとして役立ちます。
Introduction
本研究では、PNSからCNSへのウイルスの複製と拡散および関連する神経炎症反応を調査するためのフットパッド接種モデルについて説明する。フットパッド接種モデルは,、ニューロン1、2、32におけるαヘルペスウイルス感染を研究するために集中的1に使用されている。3このモデルの主な目的は、神経刺激性ウイルスがCNSに到達する前にPNSを通って最大距離を移動できるようにすることです。ここでは、このモデルは、疑似狂犬病ウイルス(PRV)に感染したマウスにおける特定の神経障害(神経障害性かゆみ)の発症における新たな洞察を得るために使用される。
PRVは、いくつかのよく知られた病原体(すなわち、単純ヘルペス1型および2型[HSV1およびHSV2]および水痘帯状疱疹ウイルス[VZV])に関連するアルファヘルペスウイルスであり、それぞれ4の冷たいびらん、性器病変、および水疱瘡を引き起こす。これらのウイルスは、すべてのパントトロピックと特定の組織タイプの親和性を示すことなく、多くの異なる細胞型に感染することができます.しかし、それらはすべて、宿主種のPNS(時にはCNS)に侵入することによって特徴的な神経刺激性を示す。自然宿主は豚であるが、PRVはほとんどの哺乳動物に感染する可能性がある。これらの非自然な宿主では、PRVはPNSに感染し、「狂ったかゆみ」と呼ばれる重篤な掻痒を誘発し、その後に急性期死亡55、66が続く。PRV感染の臨床結果および病因における神経免疫応答の役割は十分に理解されていない。
フットパッド接種モデルは、PRVがフットパッドの表皮細胞に感染を開始することを可能にする。その後、感染は表皮、汗腺、真皮を内面化する感覚神経線維と交感神経線維に広がる。この感染は、約60時間以内に神経坐骨神経を介してDRGに移動するウイルス粒子によって広がる。感染は脊髄を通って広がり、動物がモリバンドになると最終的に後脳に達する(感染後82時間)。この時間枠の間に、組織サンプルはウイルス複製および免疫応答のマーカーについて収集、処理、および分析することができる。例えば、組織学的検査とウイルス負荷の定量は、PRV病原性における臨床的、ウイルス学的、および神経炎症性プロセスの開始と開発との間の相関関係を確立するために、異なる組織で行うことができる。
フットパッド接種モデルを用いて、マウスにおけるPRV誘発性掻痒の細胞および分子機構を調べることができます。さらに、このモデルは、ヘルペスウイルス感染時のウイルス誘発性神経炎症の開始および発症に関する新たな洞察を提供することができる。αヘルペスウイルス誘発性神経障害の根底にあるプロセスをよりよく理解することは、革新的な治療戦略の開発につながる可能性があります。例えば、このモデルは、ヘルペス後病変(例えば、帯状疱疹、帯状疱疹)を有する患者における神経因性かゆみのメカニズムを調べ、対応するヒト疾患に対するマウスの新規治療標的を試験するのに有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するフットパッド接種モデルは、αヘルペスウイルス感染時の神経炎症反応の開始および発達を調べるのに有用である。さらに、このin vivoモデルは、PNSからCNSへのαヘルペスウイルスの複製および拡散の運動学を確立するために使用される。これは、深い真皮掻き傷13に依存する腹面皮膚接種モデル、またはCNS,14、15、16,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、チャールズ川研究所が組織病理学分析を実行する優れた技術サポートを認めている。この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(NINDS)(RO1 NS033506およびRO1 NS060699)によって資金提供されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| Antibody anti-PRV gB | Made by the lab | 1/500 dilution | |
| Aqua-hold2 pap pen red | Fisher scientific | 2886909 | |
| Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files) | Revlon | ||
| Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| C57BL/6 mice (5-7 weeks) | The Jackson Laboratories | ||
| DAPI solution (1mg/ml) | Fisher scientific | 62248 | 1/1000 dilution |
| Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm | Sigma-Aldrich | P5731500 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30022 | |
| Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30028 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone, GE Healthcare life Sciences | SH30088 | |
| Fine curved scissors stainless steel | FST | 14095-11 | |
| Fluoromount-G mounting media | Fisher scientific | 0100-01 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Microcentrifuge tube 2ml | Denville Scientific | 1000945 | |
| Microtube 1.5ml | SARSTEDT | 72692005 | |
| Negative goat serum | Vector | S-1000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 154022 | |
| Precision Glide needle 18G | BD | 305196 | |
| Razor blades steel back | Personna | 9412071 | |
| RNA lysis buffer (RLT) | Qiagen | 79216 | |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | Qiagen | 69989 | |
| Superfrost/plus microscopic slides | Fisher scientific | 12-550-15 | |
| Tissue lyser LT | Qiagen | 69980 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 | |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | 1/2000 dilution |
References
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