Utvärdering av oxidativ stress i biologiska prover med hjälp av den tiobarbituriska syrareaktiva ämnena
Summary
Målet med de tiobarbituriska syrareaktiva ämnena är att bedöma oxidativ stress i biologiska prover genom att mäta produktionen av lipidperoxidationsprodukter, främst malondialdehyd, med hjälp av synlig våglängdsspektrotometri vid 532 nm. Metoden som beskrivs här kan tillämpas på humant serum, cell lysates och låg densitet lipoproteiner.
Abstract
Trots sin begränsade analytiska specificitet och robusthet har tbarbituriska syrareaktiva ämnen (TBARS) analys använts i stor utsträckning som ett generiskt mått på lipidperoxidation i biologiska vätskor. Det anses ofta vara en bra indikator på nivåerna av oxidativ stress i ett biologiskt prov, förutsatt att provet har hanterats och lagrats korrekt. Analysen innebär reaktion av lipidperoxidationsprodukter, främst malondialdehyd (MDA), med tiobarbitursyra (TBA), vilket leder till bildandet av MDA-TBA2-adduat som kallas TBARS. TBARS ger en rödrosa färg som kan mätas spektrofotometriskt vid 532 nm. TBARS-analysen utförs under sura förhållanden (pH = 4) och vid 95 °C. Ren MDA är instabil, men dessa villkor tillåter frisättning av MDA från MDA bis (dimetyl acetal), som används som analytisk standard i denna metod. TBARS-analysen är en enkel metod som kan slutföras på ca 2 timmar. Beredning av analysreagenser beskrivs i detalj här. Budgetmedvetna forskare kan använda dessa reagenser för flera experiment till en låg kostnad snarare än att köpa ett dyrt TBARS-analyskit som bara tillåter konstruktion av en enda standardkurva (och därmed endast kan användas för ett experiment). Tillämpligheten av denna TBARS-analys visas i humant serum, lipoproteiner med låg densitet och cell lysates. Analysen är konsekvent och reproducerbar, och gränsvärden för detektion av 1,1 μM kan uppnås. Rekommendationer för användning och tolkning av spektrofotometrisk TBARS-analysen ges.
Introduction
Lipidperoxidation är en process där fria radikaler, såsom reaktiva syrearter och reaktiva kvävearter, angriper kol-kol dubbelbindningar i lipider, en process som innebär abstraktion av ett väte från ett kol och införande av en syremolekyl. Denna process leder till en blandning av komplexa produkter inklusive lipidperoxyl radikaler, och hydroperoxider som primära produkter, liksom malondialdehyd (MDA) och 4-hydroxynonenal som dominerande sekundära produkter1.
MDA har använts i stor utsträckning inom biomedicinsk forskning som en markör för lipidperoxidation på grund av dess lättsamma reaktion med tiobarbitursyra (TBA). Reaktionen leder till bildandet av MDA-TBA2, en konjugat som absorberar i det synliga spektrumet vid 532 nm och producerar en rödrosa färg2. Andra molekyler som härrör från lipidperoxidation förutom MDA kan också reagera med TBA och absorbera ljus vid 532 nm, vilket bidrar till den totala absorptionssignalen som mäts. På samma sätt kan MDA reagera med de flesta andra stora klasser av biomolekyler, vilket potentiellt begränsar dess tillgänglighet för reaktion med TBA3,4. Som sådan anses denna traditionella analys helt enkelt mäta “tiobarbituriska syrareaktiva ämnen” eller TBARS5.
När TBARS-analysen tillämpas och tolkas korrekt anses den i allmänhet vara en bra indikator på de totala nivåerna av oxidativ stress i ett biologiskt prov6. Tyvärr, som dokumenterats av Khoubnasabjafari och andra, utförs och tolkas TBARS-analysen ofta på ett sätt som underlättar tvivelaktiga slutsatser3,4,7,8,9,10,11. Orsakerna till detta är främst rotade i provrelaterade föranalytiska variabler och en brist på analys robusthet som förbjuder till synes mindre variationer i analysprotokollet utan betydande förändringar i analysresultat1,7,12,13.
Preanalytiska variabler relaterade till hantering och lagring av biospecimen (t.ex. blodplasma som tillfälligt hålls vid -20 °C)14,15 kan ha en stor inverkan på TBARS-analysresultat16,17; så till den grad att TBARS-analysresultat inte bör jämföras mellan olika laboratorier om det inte motiveras av uttryckliga interlaboratory analytiska valideringsdata. Denna rekommendation liknar hur västerländska fläckar används och tolkas ofta. Jämförelser av bandtätheter gäller för inom-blot och kanske inom laboratoriestudier, men att jämföra bandtätheter mellan laboratorier anses i allmänhet vara en ogiltig praxis.
Vissa forskare har föreslagit att MDA mätt med TBARS-analysen helt enkelt inte uppfyller de analytiska eller kliniska kriterier som krävs för en acceptabel biomarkör3,9,10,18,19. Om analysen inte hade utvecklats för över 50 år sedan skulle den förmodligen inte ha fått den utbredda användning och underförstådda acceptans som den har i dag. Även om det finns andra analyser med större analytisk känslighet, specificitet och robusthet som används för att bestämma oxidativ stress, är TBARS-analys baserad på absorbans vid 532 nm fortfarande överlägset en av de mest använda analyserna för bestämning av lipidperoxidation20, och därmed bedömning av oxidativ stress.
TBARS-analysen kan endast hittas som ett dyrt kit (över 400 amerikanska dollar), där instruktionerna inte ger detaljerad information om de flesta koncentrationer av de reagenser som används. Dessutom kan de tillhandahållna reagenserna endast användas för ett experiment, eftersom endast en kolorimetrisk standardkurva kan göras per sats. Detta kan vara problematiskt för forskare som avser att bestämma oxidationsnivåer inom några få prover vid olika tidpunkter, eftersom samma standardkurva inte kan användas vid flera tillfällen. Därför måste flera kit köpas för flera experiment. För närvarande, om inte ett dyrt kit köps, finns det inte ett detaljerat protokoll tillgängligt för hur man utför en TBARS-analys. Vissa forskare har tidigare vagt beskrivit hur man utför en TBARS-analys21,22, men varken ett helt detaljerat protokoll eller omfattande video om hur man utför TBARS-analysen utan ett dyrt kit finns i litteraturen.
Här rapporterar vi en detaljerad, analytiskt validerad för-ändamål metodik om hur man utför en TBARS-analys på ett enkelt, reproducerbart och billigt sätt. Förändringar i lipidperoxidation av humant serum, HepG2 lysates och låg densitet lipoproteiner vid behandling med Cu(II) joner visas som illustrativa tillämpningar för TBARS-analysen. Resultaten visar att denna TBARS-analys är konsekvent och reproducerbar dagligen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trots sina begränsningar1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 och brist på lämplighet för jämförelse mellan laboratorier, är TBARS-analysen en av de <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen som rapporterades här stöddes delvis av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelning nr. R33 CA217702 och initiativet för att maximera studentutveckling (IMSD) programmet. Innehållet är endast författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på National Institutes of Health.
Materials
| 1x Sterile PBS pH 7.4 1 L | VWR, PA | 101642–262 | cell lysis reagent |
| 50 mL self-standing centrifuge tube | Corning, NY | CLS430897 | General material |
| 96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile | Thermo Fisher Scientific, MA | 280895 | To measure absorbance |
| Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device | Fisher Scientific, NH | UFC510024 | LDL purification |
| Caps for glass tubes | Thermo Fisher Scientific, MA | 14-930-15D | for TBARS assay |
| Copper II Chloride | SIGMA, MO | 222011-250G | to induce oxidation |
| Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm) | VWR, PA | 53283-800 | for TBARS assay |
| Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) | ATCC, VA | HB-8065 | HepG2 cell media |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | eppendorf, NY | 22363204 | General material |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL | Genesee Sceitific, CA | 22363352 | General material |
| Fetal Bovine Serum US Source | Omega Scientific, CA | FB-11 | for cell culture |
| Glacial Acetic Acid | SIGMA, MO | 27225-1L-R | TBARS Reagent |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermo Scientific, MA | 87786 | cell lysis reagent |
| HEPES | SIGMA, MO | H3375-250G | LDL solvent |
| HepG2 Cells | ATCC, VA | HB-8065 | Biological matrix prototype |
| Hydrocloric acid (HCl) | Fisher Scientific, NH | A144-212 | cell lysis reagent |
| Legend Micro 17 Centrifuge | Thermo Scientific, MA | 75002431 | General material |
| Low Density Lipoprotein, Human Plasma | Athens Research & Technology, GA | 12-16-120412 | Biological matrix prototype |
| Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment | VWR, PA | 58948-025 | General material |
| Malondialdehyde bis (dimethyl acetal) | SIGMA, MO | 8207560250 | TBARS Standard |
| Multiskan Go Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific, NH | 51119200 | To measure absorbance |
| NP-40 | EMD Millipore Corp, MA | 492016-100ML | cell lysis reagent |
| Sodium Chloride | SIGMA, MO | S7653-1KG | cell lysis reagent |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA, MO | 436143-100G | TBARS Reagent |
| Sodium hydroxide | SIGMA, MO | 367176-2.5KG | TBARS Reagent |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific, MA | SC250EXP | For concentrating cell lysates |
| T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap | USA Scientific, FL | 658175 | cell culture |
| Thiobarbituric Acid | SIGMA, MO | T5500-100G | TBARS Reagent |
| TRIS base | Fluka, GA | 93362 | cell lysis reagent |
| Trypsin (1x) | VWR, PA | 16777-166 | To detach HepG2 cells |
References
- Tsikas, D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Analytical Biochemistry. 524, 13-30 (2017).
- Ohkawa, H., Ohishi, N., Yagi, K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with thiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 19 (8), 1053-1057 (1978).
- Khoubnasabjafari, M., Soleymani, J., Jouyban, A. Avoid Using Spectrophotometric Determination of Malondialdehyde as a Biomarker of Oxidative Stress. Biomarkers in Medicine. 12 (6), 551-554 (2018).
- Morales, M., Munné-Bosch, S. Malondialdehyde: Facts and artifacts. Plant Physiology. 180 (3), 1246-1250 (2019).
- Devasagayam, T. P. A., Boloor, K. K., Ramasarma, T. Methods for estimating lipid peroxidation: An analysis of merits and demerits. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 40 (5), 300-308 (2003).
- Dasgupta, A., Klein, K. Methods for Measuring Oxidative Stress in the Laboratory. Antioxidants in Food, Vitamins and Supplements. , 19-40 (2014).
- Wade, C. R., van Rij, A. M. Plasma malondialdehyde, lipid peroxides, and the thiobarbituric acid reaction. Clinical Chemistry. 35 (2), 336-336 (1989).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Reliability of malondialdehyde as a biomarker of oxidative stress in psychological disorders. BioImpacts. 5 (3), 123-127 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments Concerning “Comparison of Airway and Systemic Malondialdehyde Levels for Assessment of Oxidative Stress in Cystic Fibrosis”. Lung. 193 (5), 867-868 (2015).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Vaez-Gharamaleki, J., Jouyban, A. Comments on “Salivary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, malondialdehyde, vitamin C, and vitamin E in oral pre-cancer and cancer: diagnostic value and free radical mechanism of action”. Clinical Oral Investigations. 20 (2), 395-396 (2016).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Comments on “An Investigation into the Serum Thioredoxin Superoxide Dismutase, Malondialdehyde, and Advanced Oxidation Protein Products in Patients with Breast Cancer”. Annals of Surgical Oncology. 24, 573-576 (2017).
- Azizi, S., et al. Effects of analytical procedures on the repeatability of malondialdehyde determinations in biological samples. Pharmaceutical Sciences. 23 (3), 193-197 (2017).
- Azizi, S., et al. A possible reason for the low reproducibility of malondialdehyde determinations in biological samples. Bioanalysis. 8 (21), 2179-2181 (2016).
- Wasowicz, W., Neve, J., Peretz, A. Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid- reactive substances in serum: Importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage. Clinical Chemistry. 39 (12), 2522-2526 (1993).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Buege, J. A., Aust, S. D. Microsomal lipid peroxidation. Methods in Enzymology. 52, 302-310 (1978).
- Gutteridge, J. M. C. Free-Radical Damage to Lipids, Amino-Acids, Carbohydrates and Nucleic-Acids Determined by Thiobarbituric Acid Reactivity. International Journal of Biochemistry. 14 (7), 649-653 (1982).
- Khoubnasabjafari, M., Ansarin, K., Jouyban, A. Salivary malondialdehyde as an oxidative stress biomarker in oral and systemic diseases. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects. 10 (2), 71-74 (2016).
- Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: How should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
- Lee, R., et al. Evaluating oxidative stress in human cardiovascular disease: methodological aspects and considerations. Current medicinal chemistry. 19 (16), 2504-2520 (2012).
- Morel, D. W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid. Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).
- Guzmán-Chozas, M., Vicario-Romero, I. M., Guillén-Sans, R. 2-thiobarbituric acid test for lipid oxidation in food: Synthesis and spectroscopic study of 2-thiobarbituric acid-malonaldehyde adduct. Journal of the American Oil Chemists Society. 75 (12), 1711-1715 (1998).
- Shibata, T., et al. Identification of a lipid peroxidation product as a potential trigger of the p53 pathway. Journal of Biological Chemistry. 28 (2), 1196-1204 (2006).
- Skoog, D. A., West, D. M., Holler, F. J., Crouch, S. R. Sampling, standardization, and calibration. Fundamentals of Analytical Chemistry. 9th ed. , 153-196 (2014).
- Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Introduction. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. , 1-24 (2007).
- Seibig, S., Van Eldik, R. Kinetics of [FeII(edta)] Oxidation by Molecular Oxygen Revisited. New Evidence for a Multistep Mechanism. Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).
- Jeffs, J. W., et al. Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).
- Yagi, K., Armstrong, D. Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma. Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).
- Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).
- Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents. Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).
- Kwon, T. W., Watts, B. M. Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry. Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).
- Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radical Biology & Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).
- Jentzsch, A. M., Bachmann, H., Fürst, P., Biesalski, H. K. Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids. Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).
- Jo, C., Ahn, D. U. Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey. Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).
- Tsikas, D., et al. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).
- Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage. Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).
- Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).
- Lee, D. M. Malondialdehyde in Stored Plasma. Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).
- Tsikas, D., et al. Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration. Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).
