Vi præsenterer en protokol for isolering af endokardie- og koronarenendotelceller fra rottehjerter gennem sekventiel vævsfordøjelse i en fordøjelsesbuffer, cellesamling fra tilbagevendende centrifugecyklusser og cellerensning ved hjælp af anti-rotte CD31 mikroperler.
Det er blevet påvist, at endokardie-endotelceller (EECs) og koronar endotelceller (CFC) varierer i oprindelse, udvikling, markører og funktioner. Derfor spiller disse to cellepopulationer en unik rolle i hjertesygdomme. Aktuelle undersøgelser, der involverer isolerede endotelceller, undersøger cellepopulationer bestående af både EEC’er og central- og østeuropæiske lande. Denne protokol skitserer en metode til selvstændigt at isolere disse to cellepopulationer til cellespecifik karakterisering. Efter indsamlingen af den venstre og højre ventrikelfri væg frigøres endotelceller fra den ydre overflade og indersiden separat ved hjælp af en fordøjelsesbufferopløsning. Den sekventielle fordøjelse af den ydre overflade og det indre endokardielag beholdt adskillelse af de to endotelcellepopulationer. Den særskilte isolering af eIC’er og central- og østeuropæiske lande kontrolleres yderligere ved at identificere markører, der er specifikke for hver enkelt population. Baseret på tidligere offentliggjorte enkeltcelleRNA profilering i mus hjertet, Npr3, Hapln1, og Cdh11 genekspression er unik for EECs; mens Fabp4, Mgllog Cd36-genekspression er unikke for central- og østeuropæiske lande. Cd36 qPCR-data afslørede beriget udtryk for disse karakteristiske markører i deres respektive prøver, hvilket indikerer vellykket EØF- og CEC-isolation samt vedligeholdelse af cellefænotype, hvilket muliggør yderligere cellespecifik funktionel analyse.
Denne artikel indeholder en detaljeret protokol (ændret fra Gladka et al.1) for dissektion og efterfølgende isolering af endokardie-endotelceller (EECs) og koronar endotelceller (CFC) fra rottehjerter. Evnen til at undersøge disse cellepopulationer uafhængigt ville gøre det muligt at udforske celletypespecifikke mekanismer, der ligger til grund for en række hjertesygdomme, der kan tjene som potentielle terapeutiske mål. En vellykket metode til indsamling af disse cellepopulationer uafhængigt er endnu ikke offentliggjort, dog.
De central- og østeuropæiske lande adskiller sig fra de europæiske erhvervs- og østeuropæiske lande med hensyn til deres oprindelse, markører og funktioner under hjerteudvikling og sygdom1,2,3,4,5,6,7. EECs stammer fra den ventrale overflade af hjertemesoderm3. De opstår fra Flk1+ progenitor celler som reaktion på VEGF og HIF signalering og danner det inderste lag af de tre diskrete regioner i udviklingslandene hjerte: atrium, hjertekammer, og sinus venosus3,6. Genetisk afstamning sporing tyder på, at de pluripotente endokardieceller i sinus venosus udlede venøse celler, som migrerer til at danne det subepikardielag3. Efterfølgende, det subepikardielag differentieres i kranspulsårer og vener, herunder cfcs, som forbliver på tværs af den perifere ventrikulære fri væg3,4. Denne endocardial til endotel vej er reguleret af VEGFC, ELA / APJ, og SOX17 signalering3,,4,,6,8,9. Den ventrikulære endokardiet stammer færre ccc’er af interventrikulær septum ved en ukendt mekanisme3. Efterfølgende foreslås lokaliseret differentiering mellem eIC’er og central- og østeuropæiske lande af markører, der er specifikke for disse to cellepopulationer, herunder Mgll, Fabp4 og Cd36-udtryk i central- og østeuropæiske lande eller Npr3- og Cdh11- og Hapln1-udtryk i EECs3,5,10.
EECs og central- og østeuropæiske lande spiller forskellige roller i hjertefunktion. Endokardie til mesenkymal overgang, ventil dannelse, kammer modning, udstrømning tarmkanalen regulering, og atrioventrikulære kanal udvikling er betinget af EECs6. Alternativt bidrager central- og østeuropæiske lande til vasomotorisk tone og betændelse i kranspulsårerne11. Disse udsving i funktion resulterer i individualiserede roller i sygdomsudviklingen4,12. For eksempel tyder tyder på, at funktionssvigt EECs kan føre til medfødt ventilsygdom6, noncompaction myokardi6, atrioventrikulær septal effekt6, endokardiefibroelastose13, hypoplastisk venstre hjertesyndrom13, ventrikelhypoplasi13, og hjertehypertrofi12. Tilsvarende har undersøgelser vist, at unormale central- og østeuropæiske lande bidrager til koronararteriesygdom14 og trombose11.
En vellykket isolering af e-pc’er og central- og østeuropæiske lande er nødvendig for at opnå omfattende viden om disse to cellepopulationer, som kan udnyttes i både forskning og kliniske miljøer. Fastlæggelsen af disse cellepopulationers vækst- og differentieringsfaktorer vil være en reference for differentieringen af endotelundertyper fra inducerede pluripotente stamceller (iPSC). Endvidere er fuldstændig identifikation af varianserne i udviklingen, reguleringen og funktionen af e-pc’er og central- og østeuropæiske lande afgørende for forståelsen af de genomiske og epigenomiske faktorer, der er ansvarlige for talrige hjertesygdomme på en celletypespecifik måde. I denne artikel beskrives trin en vellykket samling af eIC’er og central- og østeuropæiske lande uafhængigt og giver dokumentation for adskillelse ved at vurdere genekspressionsniveauerne for celletypespecifikke markører.
Central- og østeuropæiske lande og eIC’er har forskellig oprindelse, markører og funktioner og kan derfor spille en unik rolle i udvikling og sygdom. De eksisterende protokoller for endotelcelleisolation er begrænset til makrovaskulært væv, hvilket forsømmer indsamlingen af e-pc’er og begrænser således studiet af CEC- og EØF-specifikke funktioner. Det er vigtigt at isolere og undersøge disse to populationer uafhængigt, da denne viden vil danne grundlag for differentieringen af iPS’er i central- og østeuropæiske lande med henblik på fremtidige undersøgelser og lette undersøgelsen af disse cellepopulationer for potentielle terapeutiske mål for forskellige hjertesygdomme. Denne nye protokol skitserer en metode til isolering af EECs fra den indre overflade og central- og østeuropæiske lande fra den ydre overflade af ventrikelfri væg af voksne rotter.
Det er afgørende at kontrollere timingen for hvert trin meget præcist i denne protokol. Fordi antallet af EECs er meget begrænset i rotte hjertevæv, minimerede vi fordøjelsestiden for det indre lag af hjertet for at forhindre cellulære skader og endnu vigtigere, CEC forurening. Øjeblikkelig tilføjelse af EF-mediet opløsning til at afslutte den enzymatiske reaktion er også meget vigtig for at opretholde høj cellelevedygtighed. En rød pellet efter cellesamling tyder på tilstedeværelsen af et stort antal RBC’er. Afhængigt af mængden af RBC-kontaminering kan der tilsættes 1-2 ml RBC lysisbuffer for at nedbryde RBC. Ved hjælp af den nuværende protokol, var vi i stand til at isolere 105 EECs fra seks rotte hjerter. Disse celler kunne seedet på en celle kultur parabol for yderligere ekspansion og karakterisering.
Ved klargøring af vævet til fri vægopsamling blev hjertet vasket med HBSS for at fjerne størstedelen af de resterende RBC’er. HBSS er det anbefalede medium på grund af dets klare udseende, som gør det muligt at rekvirere blodceller, i modsætning til DMED indeholdende fenolrød. Sammensætningen af fordøjelsesbufferen sikrer tilstrækkelig frigørelse af endotelceller, hvor liberase fordøjelsesenzym strimler væv af de eksponerede celler, DNase Jeg fjerner DNA fra de døde celler til at fremme celle løsrivelse, der kan hæmmes af DNA’s klæbende kvalitet, HEPES buffer afbalancerer pH, og DMEM er en modificeret basal medium med en højere koncentration af aminosyrer og vitaminer for bedre celle vedligeholdelse og indeholder calcium er nødvendige for at aktivere liberase.
Ifølge enkeltcelleRNA-sekvenseringen (scRNA-seq) fra både human15 og musehjertet10blev der rapporteret flere markører, der tilskrives specifikke EF-populationer. Vi valgte nogle af de mest berigede gener til at undersøge renheden af isolerede EECs (dvs. Npr3, Cdh11, og Hapln1) og EECs (dvs. Mgll, Fabp4, og Cd36). I forhold til β-Actin, Npr3, Cdh11og Hapln1-markørerne viste øget udtryk i eECs sammenlignet med central- og østeuropæiske lande. På samme måde var udtrykket af Mgll-, Fabp4-og Cd36-markører større i central- og østeuropæiske lande sammenlignet med eIC’er. De entydigt udtrykte markører for hver prøve er i overensstemmelse med markører, der er karakteristiske for henholdsvis EEC’er og central- og østeuropæiske lande, hvilket indikerer vellykket isolation.
Den nuværende protokol kan imidlertid ikke udelukke krydskontaminering mellem de to EF-populationer under isoleringen, selv ikke med omhyggeligt kontrollerede sekventielle fordøjelser. Derfor kan nogle celleoverflademarkører anvendes til yderligere rensning. F.eks. mærker NPR3 generelt endokardiet10, mens APJ kan spore et flertal af central- og østeuropæiske lande16. Da disse to markører udtrykkes på celleoverfladen, kan de anvendes til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og antistoffer, der anvendes til yderligere at rense forskellige EF-populationer. Desuden kan human15 og mus10 hjerte scRNA-seq bekræfte berigelse af Npr3 i EECs, og Cd36 kan potentielt anvendes til CEC rensning.
Afslutningsvis skitserer den fremlagte protokol den uafhængige isolering af e-pc’er og central- og østeuropæiske lande fra rottehjertet. Den omfattende identifikation af cellulære egenskaber, aktiveret af celle isolation, kan udnyttes til betydelige downstream applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne sætter stor pris på Dr. Lingli Wang for hendes hjælp med dyret protokol, og Department of Pediatrics på Stanford for infrastruktur støtte. Dette arbejde blev støttet af NIH/NHLBI K99 HL135258 (til M.G.).
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | 1M |
15ml Tubes | Eppendorf | 0030122151 | |
50ml Tubes | Nunc | 339652 | |
5ml Tubes | Eppendorf | 30119401 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
Anti-CD31 PE | Miltenyi Biotec | 130-115-505 | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | 10% |
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-rad | 1855485 | For qPCR |
DNAse I | Worthington | LK 003172 | 1 mg/mL in water |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10313021 | |
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza | CC-3162 | EC Medium |
Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1 | Gibco | 14025092 | |
Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white | Bio-rad | HSP3805 | For qPCR |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
Liberase TM | Sigma Aldrich | 5401119001 | 5 mg/mL |
MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | For EC isolation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | For EC isolation |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-rad | MSB1001 | For qPCR |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | For heart harvest |
Nylon Sterile Strainer | Falcon | 352340 | 40 mm |
Phosphate Buffered Saline (PBS) X1 | Gibco | 1001023 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | For qPCR |
Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1050 | For RNA extraction |
S&T Forceps – SuperGrip Tips | F.S.T | 00632-11 | For heart harvest |
Strabismus Scissors – Tungsten Carbide | F.S.T | 14574-11 | For heart harvest |
Vannas Spring Scissors – Microserrated | F.S.T | 15007-08 | For heart harvest |