I den här artikeln beskrivs ett protokoll med hög genomströmning för snabb och tillförlitlig bestämning av genuttrycksnivåer i enstaka eller bulk C. elegans prover. Detta protokoll kräver inte RNA-isolering och producerar cDNA direkt från prover. Det kan användas tillsammans med höggenomströmning multiplexerade nanofluidiska qPCR-plattformar i realtid.
Detta dokument presenterar en hög genomströmning omvänd transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) analys för Caenorhabditis elegans som är snabb, robust och mycket känslig. Detta protokoll erhåller exakta mätningar av genuttryck från enstaka maskar eller från bulkprover. Protokollet som presenteras här ger en ny anpassning av befintliga metoder för kompletterande DNA (cDNA) förberedelse i kombination med en nanofluidic RT-qPCR plattform. Den första delen av detta protokoll, med namnet “Worm-to-CT”, tillåter cDNA-produktion direkt från nematoder utan behov av tidigare mRNA-isolering. Det ökar experimentell genomströmning genom att tillåta beredning av cDNA från 96 maskar i 3,5 h. Den andra delen av protokollet använder befintlig nanofluidisk teknik för att köra RT-qPCR med hög genomströmning på cDNA. Detta dokument utvärderar två olika nanofluidiska chips: de första kör 96 prover och 96 mål, vilket resulterar i 9 216 reaktioner på cirka 1,5 dagars bänkarbete. Den andra chiptypen består av sex 12 x 12 matriser, vilket resulterar i 864 reaktioner. Här demonstreras Worm-to-CT-metoden genom att kvantifiera mRNA-nivåer av gener som kodar värmechockproteiner från enstaka maskar och från bulkprover. Provided är en omfattande lista över primers utformade för att förstärka bearbetat RNA för majoriteten av kodningsgener inom C. elegans genomet.
Optimeringen av encellig RNA-sekvensering och qPCR visade att transkriptionspulser eller bursts kan leda till massiv variation i antalet RNA-molekyler per cell1. Vidare upptäckte dessa tekniker betydande cellulära heterogenitet som tidigare missats av standard bulk transkriptomiska mätningar. Beroende på sammanhanget orsakas vissa encelliga transkriptionsvariationer av blandad cellulär sammansättning av vävnader. Men även i isogena cellpopulationer som odlas under samma miljö finns det utbredd transkriptionellheterogenitet 2,3. Denna “biologiska variabilitet” identifieras alltmer som en allestädes närvarande egenskap hos cellulära nätverk, från bakterier till människor. I vissa fall kan det ha fenotypiska konsekvenser i utveckling, cancerprogression, HIV-latens och svar på kemoterapi4,5.
Nematoden Caenorhabditis elegans är en unik modellorganism med idealiska egenskaper för att studera orsakerna till och konsekvenserna av biologisk variabilitet mellan individer. Dessa nematoder är en enkel modellorganism bestående av 959 celler, och deras genomskinliga nagelband gör dem mottagliga för in vivo-avbildningsstudier6. C. elegans är en hermafroditisk art som huvudsakligen reproducerar sig genom självbefruktning; detta resulterade i isogena laboratoriestammar. Trots isogenicitet och kontrollerade odlingsförhållanden är många fenotyper och transkriptioner varierande mellan individer, vilket tyder på att stokastiska eller mikromiljömässiga skillnader bidrar till heterogenitet mellan individer7,8. Sådan variabilitet i genuttryck har flera fitnesskonsekvenser, inklusive variabilitet i penetransen av mutationer, överlevnad, utvecklings timing och fecundity7,8,9. På grund av dessa funktioner ger enmaskstudier den oöverträffade möjligheten att studera biologisk variabilitet i en hel organism.
Det finns ett grundläggande behov inom området att utveckla och optimera teknik för korrekt detektering av transkriptioner på en enda masknivå. Ny teknik, såsom enmaskig RNA-sekvensering10,RNA-sekvensering från isoleradevävnader 11, och encelligsekvensering 12 finns nu tillgängliga för C. elegans. En huvudutmaning kvarstår dock: vid övervakning av interindividualitet faller svagt uttryckta gener ofta under detekterbara nivåer13. Detta är särskilt relevant för sällsynta transkriptioner som isolerats från små mängder utgångsmaterial, eftersom det finns ett väletablerat, omvänt samband mellan genomsnittligt uttryck och teknisk varians, vilket ofta orsakar sällsynta transkriptioner att falla under statistiska brytningar13. Optimeringen av multiplexed qPCR-teknik med hög genomströmning har visat sig vara användbar för encelliga studier på däggdjur, särskilt när man studerar uttrycket av sällsyntatranskriptioner 14,15. Denna teknik kan också användas för benchmarking och validering av andra enmaskiga tekniker.
Worm-to-CT är en snabb, robust metod anpassad från ett kit som används i cellbiologistudier, för cDNA-beredning med en mask. cDNA erhölls med denna metod tillsammans med multiplexerad nanofluidisk qPCR-teknik valdes eftersom den ger högre experimentell genomströmning, ett bredare dynamiskt detektionsområde och har validerats för encelligaändamål 14,15. CDNA-preparatet som beskrivs är också tillämpligt för användning med standard PCR-teknik. Genomströmningen ökas på två sätt: För det första är cDNA-preparatet snabbare och mer tillförlitligt än traditionell guanidium tiocyanat-fenol-kloroform extraktion, eftersom maskar läggs direkt till lysisbufferten och hoppar över direkt isolering av lätt nedbrytbart RNA. För det andra ökar användningen av nanofluidisk teknik avsevärt antalet prover och mål som kan köras samtidigt. I det här dokumentet jämförs två chips: ett chip med en matris och ett chip med flera matriser. Ett chips med en matris kan köra 96 enkla maskar och 96 primeruppsättningar, vilket resulterar i 9 216 reaktioner per experiment. För att utföra ett liknande data flöde med hjälp av standard qPCR-tekniker skulle det krävas 96 separata qPCR-experiment med hjälp av 96 brunnsplattor. Det mindre och mer flexibla multimatrischipet består av sex 12 x 12 matriser vilket resulterar i 864 reaktioner. Metodens överlägsna tillförlitlighet och känslighet ökas av nanofluidisk teknik och genom införandet av ett förförökningssteg. Metoden som presenteras i detta dokument är avsedd att användas tillsammans med en toppmodern statistisk algoritm för att extrahera biologisk varians. Den här artikeln presenterar protokollet för snabb cDNA-förberedelse och qPCR med hög genomströmning för både enmask- och batchmaskprover. algoritmen kommer att publiceras någon annanstans. För det här protokollet bör organisationen för varje chip förberedas före experimentet. Tabell 1 och tabell 2 visar exempel på dessa planer för ett chip med flera matriser respektive en matris. Det finns också översikter över Worm-to-CT-protokollet som beskrivs i figur 1 och som kör chipsen med flera matriser och en matris i figur 2.
I det här dokumentet visas Worm-to-CT-protokollet vara en snabb och effektiv metod för att extrahera RNA från enstaka maskar eller en liten pool av maskar. Det höggenomströmning som erbjuds av det nanofluidiska systemet gör det idealiskt för kvantifiering av inter-individuella variabilitetsmätningar. Dessutom tillåter den höga känsligheten hos denna metod detektion av gener uttryckta vid låga nivåer som faller under detektion när du använder RNA-seq-teknik med en mask9.
När man överväger valet av metod för att förbereda cDNA från enstaka maskar. Ly et al.29 optimerade ett protokoll som förlitar sig på proteinas K för nagelbands matsmältning. Nagelbandet är ett stort hinder för isolering av molekyler från maskar och proteinas K ger en effektiv metod för att bryta den. Proteinas K måste dock värmeinaktiveras för att kunna använda enzymer för omvänd transkription. Medan Ly et al. använde en 10 min exponering för 96 °C, undveks detta steg i detta protokoll eftersom RNA är lätt nedbrytbart. I stället för att använda proteinas K användes upprepade frys-tina cykler för att bryta nagelband. Frys-tinning är en effektiv metod för att bryta nagelbandet eftersom mer RNA kan isoleras per mask. Ly et al. rapportera att det totala RNA extraheras per mask är 35 ng med proteinas K, medan detta protokoll erhåller 51,75 ng ± 6,74 SEM av totalt RNA per mask. Undvikande av värmeexponering i kombination med föramplifieringssteg breddar tydligen Worm-to-CT:s dynamiska detektionsområde jämfört med standardprotokoll. Ly et al. rapportera absoluta Ct-värden på 21,1 ± 0,15 för hsp-16,2 och 22,8 ± 0,17 för hsp-70 efter värmechock. Med samma värmechocksförhållanden (1 h vid 30 °C) erhåller detta protokoll absoluta Ct-värden på 17,93 ± 0,57 för hsp-16,2 och 21,13 ±0,33 för hsp-70. Detta indikerar att frys-tina lysis metoden ger högre utbyten av RNA och är lämpligare för lågt uttryckta transkriptioner.
Nanofluidiska system är idealiska när man undersöker en viss uppsättning målavskrifter och användningen av antingen mindre (multi-array chip) eller större (single-array chip) antal prover som möjliggör anpassning till experimentens skala. För att få en opartisk bild av alla transkriptioner uttryckta i en enda mask är det uppenbara valet att använda RNA-sekvensering. Men om fokus för experimentet är en mindre men fortfarande relativt stor uppsättning målgener är det mer kostnadseffektivt att använda detta protokoll, förutsatt att forskaren har tillgång till en nanofluidik PCR-maskin. Kostnaden för de nanofluidiska systemreagenserna och ett flischip med en matris uppskattas till cirka £ 13 per mask, medan kostnaderna för reagenserna för enkelmasksekvensering skulle vara cirka £ 60 per mask, exklusive sekvenseringskostnaderna.
När man överväger vilken PCR-plattform som ska användas erbjuder Worm-to-CT-metoden i kombination med nanofluidisk qPCR fördelar när det gäller tid och dataflöde. Det är möjligt att få 9 216 RT-qPCR-resultat på cirka 2 dagars arbete, medan förstärkning av samma antal mål med en standard qPCR-plattform skulle ta cirka 5 arbetsveckor med 96 brunnsplattaanalyser, som kör fyra plattor om dagen. Men om antalet mål som ska testas är mindre är det mer kostnadseffektivt att använda Worm-to-CT tillsammans med en vanlig qPCR-maskin. Det går inte att köra chipsen med en matris igen, så att köra tomma brunnar minskar kostnadseffektiviteten.
En begränsning av metoden är den potentiella bildandet av primer-primer dimers under multiplexeringssteget, men detta sker i mindre än 1% av fallen. Även om Worm-to-CT-protokollet är effektivt och ger tillförlitliga resultat när det appliceras på enstaka maskar, finns det en felfrekvens på cirka 5%, vilket sannolikt motsvarar fall där masken förblir instängd i locket eller toppen av röret under skördesteget.
Tillsammans erbjuder denna mångsidiga och pålitliga metod ökad genomströmning och känslighet jämfört med mer standardtekniker. Denna metod kan vara mycket användbar för validering av höggenomströmningsskärmar och är ett utmärkt val att antingen övervaka eller validera enmaskiga genuttrycksnivåer. Denna metod kan tillämpas på andra utmanande tekniker, såsom kvantifiering av genuttryck från isolerade vävnader. Till exempel ger isolering av fulla vävnader, såsom tarmarna, gonaderna eller cellerna som isolerats av FACs, tillräckligt med material för att utföra RNA-sekvenseringsexperiment. Begränsade mängder material leder dock ofta till duplicerade läsningar, vilket utesluter kvantifiering av sällsynta transkriptioner. I det här scenariot bör användning av nanofluidikbaserad teknik ge ökad känslighet för experimenten och öka kostnadseffektiviteten om forskarna bara behöver övervaka en delmängd av alla transkriptioner i dessa vävnader eller celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Sharlene Murdoch och Babraham Institute Facilities för deras stöd. JLP stöddes av Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) och OC stöds av ERC 638426 och BBSRC [BBS/E/B000C0426].
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |