Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد بنية مجهرية كسورية من Laminin-111 للإشارة إلى الخلايا

Published: September 28, 2020 doi: 10.3791/61134
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 4
1Regenerative Medicine Research, Texas Heart Institute, 2Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 3Biological Systems and Engineering, Lawrence Berkeley National Lab, 4Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Lab

Summary

وصفنا ثلاث طرق لتوليد بوليمرات Ln1 ذات خصائص كسورية تشير إلى الخلايا بشكل مختلف مقارنة ب Ln1 غير المبلمر.

Abstract

Laminin-111 (Ln1) هو جزء أساسي من المصفوفة خارج الخلية في epithelia, العضلات والنظم العصبية. لقد أثبتنا سابقا أن البنية المجهرية ل Ln1 تغير الطريقة التي تشير بها إلى الخلايا ، ربما لأن تجميع Ln1 في الشبكات يكشف عن مجالات لاصقة مختلفة. في هذا البروتوكول ، نصف ثلاث طرق لتوليد Ln1 المبلمر.

Introduction

على عكس عوامل النمو أو السيتوكينات ، يمكن أن تتجمع بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) في شبكات هيكلية. نظرا لأن الخلل الوظيفي في ECM هو عنصر أساسي في العديد من الحالات المرضية ، فإن الآليات التي تستشعر بها الخلايا الإشارات وتنقلها من تكوين ECM والبنية المجهرية والميكانيكا الحيوية هي أهداف جذابة للتطوير العلاجي. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن البنية المجهرية لهذه الشبكات تلعب دورا رئيسيا في كيفية إشارة هذه البروتينات إلى الخلايا. حتى الآن ، تم إظهار هذا الارتباط بين البنية المجهرية ECM ووظيفة الخلية للكولاجين I1 و fibronectin2 و fibrin3.

Laminin-111 (Ln1) هو بروتين ثلاثي الشكل متقاطع يعد مكونا هيكليا رئيسيا للمصفوفة خارج الخلية التي تتصل بالخلايا الظهارية4 وخلايا العضلات5 والخلايا العصبية6. في الغدة الثديية ، Ln1 ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية للغدة الثديية إلى خلايا منتجة للحليب 7،8،9 ، و Ln1 ضروري لتحريض ارتداد الورم10،11. Ln1 وغيرها من الصفيحات ضرورية لتطوير شبكات الأكتين القشرية وتنظيم الساركوليما في العضلات12،13 ، ولهجرة الخلايا العصبية ونمو الخلايا العصبية13 . وبالتالي ، فإن فهم الآليات التي يشير بها اللامينين إلى الخلايا هو مجال نشط للبحث.

يحتوي Ln1 على مجالات لاصقة متعددة لمجموعة واسعة من المستقبلات بما في ذلك الانتغرينات ، والسينديكان ، والديستروغليكان ، و LBP-110 و LamR (الشكل 1A) 4,14. جزء E8 ، الذي يحتوي على المجالات الكروية c-terminus من laminin α1 ، ضروري لربط dystroglycan و integrins α6β1 و α3β115 ، وهو ضروري للتمايز الوظيفي للخلايا الظهارية 15,16. في المقابل ، تظهر الأذرع القصيرة نشاطا بيولوجيا مختلفا17 ، مما يعني أن توفر التعرف على مجال Ln1 المختلف بعد تكوين الشبكة يمكن أن يغير سلوك الخلية.

لقد أثبتنا مؤخرا أن Ln1 مرتبة في شبكة بوليمرية تعرض خصائص كسورية (أي بنية متشابهة ذاتيا عبر مقاييس طول متعددة)18. تشير الشبكات الكسورية بشكل مختلف إلى الخلايا الظهارية مقارنة ب Ln1 ، الذي يفتقر إلى هذا الترتيب19. تشير هذه الشبكة الكسورية إلى بنية تجميع معينة ، حيث يتعرض الذراع الطويل بشكل تفضيلي للخلايا18. نتيجة لهذا العرض المختلف للذراع الطويلة ، تخضع الخلايا الظهارية للتمايز الوظيفي إلى خلايا منتجة للحليب ذات تقاطعات ضيقة جيدة التنظيم وقمع ألياف إجهاد الأكتين19.

وصفنا 3 طرق لتوليد شبكات Ln1 من تفاعلات ربط الذراع القصيرة والذراع القصيرة ، والتي تظهر عرضا عاليا للذراع الطويلة Ln1: 1) عن طريق التجميع الخالي من الخلايا مع المخازن المؤقتة الحمضية ، 2) عن طريق الحضانة المشتركة مع البروتينات السكرية ، أو 3) عن طريق التفاعل مع سطح الخلية dystroglycan. تولد هذه الطرق الثلاث هياكل مجهرية متشابهة لللامينين من خلال ثلاث آليات مختلفة للغاية ، مما يسمح بالمرونة في التصميم التجريبي. تشير الأبحاث السابقة إلى أن هذه الطرق الثلاث يمكن أن تمثل المتانة البيولوجية: في الغدة الثديية epithelia، يمكن أن يؤدي إما ديستروغليكان سطح الخلية أو البروتينات السكرية أو اللامينين ذو البنية الاصطناعية إلى تحفيز التمايز الوظيفي19. وبالتالي ، يمكن للباحثين الاختيار بين هذه الطرق بناء على موضوع الدراسة: لا تظهر خلايا التعبير عن dystroglycan أي حساسية للبنية المجهرية Ln-1 ، حيث أن dystroglycan في غشاء الخلية يحفز البلمرة الصحيحة في شبكة كسورية19,20. يمثل Matrigel ، وهو مزيج من laminins والبروتينات السكرية21 ، المصدر الأكثر اقتصادا ل Ln-1 ، ويوفر البنية المجهرية اللازمة لحث الخلايا الثديية dystroglycan بالضربة القاضية على التمييزبين 20 ، ولكنه يحتوي على مزيج معقد من البروتينات مع الكثير من التباين إلى الكثير. يمثل PolyLM النظام الأنظف والأكثر اختزالا الذي يوفر هذه الوظيفة ، ولكن بتكلفة متزايدة وفعالية أقل للحث على تمايز الخلايا الثديية مقارنة ب Matrigel19.

هذه الطرق الثلاث لها بنية شبكة كسورية مميزة للتجميع المحدود للانتشار18،19 ، وتظهر نشاطا بيولوجيا متغيرا مقارنة باللامينين المجمع في أنظمة تجريبية متعددة22،23،24،25. يمكن للدراسات المستقبلية باستخدام هذه الطرق تحديد المستقبلات والإشارات اللازمة للتمايز الظهاري وتحديد استعادة تفاعلات مصفوفة الخلايا الطبيعية في الخلايا في البيئات الدقيقةغير الطبيعية 20 ، مثل الأورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ذوبان الجليد والقسمة laminin-111

ملاحظة: يتوفر اللامينين 111 المنقى تجاريا (عادة ما يتم تنقيته من مصفوفة EHS التي تباع باسم Matrigel) ، ولكن لا توفر جميع المصادر بروتينا سليما وغير متحلل.

  1. تأكد من أن Ln1 لا يتحلل عن طريق الحصول على Ln1 وتشغيل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم26 أو الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد26. يجب أن يحتوي Ln1 المشوه على نطاقات عند 337 كيلو دالتون و 197 كيلو دالتون و 177 كيلو دالتون ، ويجب أن يكون ل Ln1 الأصلي نطاق واحد عند 711 كيلو دالتون.
  2. قم بإذابة Ln1 على الثلج في الثلاجة طوال الليل ، وقم بالقسمة في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين (عادة ما تكون القسمة عند 100 ميكروغرام / أنبوب لتراكبات الاستزراع ، أو 10 ميكروغرام للطلاء) باستخدام أطراف ربط منخفضة البروتين وتقنية معقمة27. تجمد القسامات وتخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. بلمرة اللامينين باستخدام مخازن منخفضة الأس الهيدروجيني

  1. اصنع عازلة للبلمرة polyLM: قم بوزن وخلط 1 mM CaCl2 و 20 mM من أسيتات الصوديوم في ماء فائق النقاء. ثم اضبط الرقم الهيدروجيني على 4.0 ، باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو حمض الخليك. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية.
  2. اصنع مخزن بلمرة التحكم: امزج 1 mM CalCl2 و 20 mM Tris واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 ، باستخدام 10 N HCl أو 12 N NaOH حسب الضرورة. مرشح معقم من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، ويخزن في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  3. قم بإذابة العدد المطلوب من قسامات Ln-1 في الثلاجة طوال الليل.
  4. باستخدام تقنية زراعة الخلايا المعقمة ، أضف المخزن المؤقت المناسب (إما مخزن بلمرة polyLM من الخطوة 2.1 أو مخزن بلمرة التحكم من الخطوة 2.2) إلى قسامات اللامينين بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل (أي أضف 0.5 مل إلى 50 ميكروغرام من القسامة) واخلطها برفق عن طريق الماصة.
  5. في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 وزن / وزن (على سبيل المثال 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام) واخلطه برفق عن طريق الماصة.
    ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين كركيزة لمرفق الخلية ، اتبع الخطوات 2.6-2.8:
  6. مباشرة بعد التخفيف في المخزن المؤقت المناسب ، انقل الصفيحات إلى بلاستيك أو الأواني الزجاجية واحتضانها طوال الليل في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. لاحظ أنه عند طلاء أغطية الغطاء ، أضف حجما كبيرا بما يكفي لإنتاج انخفاض متوازن (عادة ، استخدم 50 ميكرولتر لغطاء دائري 13 مم) ، واحفظه في غرفة مرطبة طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
  7. باستخدام تقنية معقمة27 ، يغسل مع 1x محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS).
  8. قم بإزالة السائل بعناية. لا تدع السطح يجف تماما.
    ملاحظة: في حالة استخدام اللامينين لتغطية الخلايا لتحريض بروتين الحليب ، اتبع الخطوات 2.9-2.12:
  9. ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.
  10. بذور خلايا DgKO و DgKI لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء
  11. احتضان اللامينين المخفف في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  12. قسام polyLM لأجهزة الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ولكن أجهزة الطرد المركزي LM في درجة حموضة محايدة عند 20000 × جم لمدة 20 دقيقة بسبب الحجم الأصغر لكيانات البروتين والحاجة إلى سرعات أعلى للتجميع بفعالية.
  13. باستخدام تقنيةالتعقيم 27 ، قم بإزالة المادة الطافية برفق ، وأعد تعليقها في حجم مناسب من وسط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين
  14. نقل اللامينين في وسط زراعة الخلايا على الفور لتحفيز الخلايا. لقد نجحنا في تحفيز الخلايا باستخدام 50-800 ميكروغرام / مل Ln1

3. بلمرة اللامينين باستخدام البروتينات السكرية المعزولة

  1. قم بإذابة nidogen-1 و Ln1 المؤتلف برفق على الثلج في الثلاجة طوال الليل.
  2. امزج Ln1 مع nidogen-1 بنسبة 1: 1 بالوزن / الوزن في وسط زراعة الخلايا باستخدام أطراف وأنابيب ربط منخفضة البروتين وباستخدام تقنية معقمة. استخدم Ln1 النقي في وسط زراعة الخلايا كعنصر تحكم.
  3. في حالة استخدام اللامينين الموسوم بالفلورسنت للتصور ، أعد تكوينه وأضفه بنسبة 1:50 بالوزن / الوزن (على سبيل المثال ، 2 ميكروغرام / 100 ميكروغرام). تخلط بلطف عن طريق الماصة.
  4. احتضان Ln1-nidogen أو التحكم في Ln1 في حاضنة زراعة الخلايا على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. البوليمرات المشتركة للطرد المركزي Ln1-nidogen عند 2000 × جم لمدة 30 دقيقة والتحكم Ln1 عند 20000 × جم لمدة 30 دقيقة.
  6. قم بإزالة المادة الطافية برفق وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا إلى تركيز نهائي يتراوح بين 100-800 ميكروغرام من البروتين الكلي / مل.
  7. استخدميه على الفور لتحفيز الخلايا ، أو انقله إلى أغطية الغطاء واتركه يلتصق طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنات زراعة الخلايا المرطبة.
  8. قم بإزالة وسط الثقافة من أغطية الغطاء ، واغسل أغطية الغطاء باستخدام 1x PBS ، ثم ثبته بنسبة 10٪ فورمالين (أي 4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

4. بلمرة اللامينين باستخدام خلايا التعبير عن الديستروغليكان

  1. ثقافة الخلايا الظهارية الثديية. ثقافة MepG dystroglycan يطرق في (DgKI) أو MepG خلايا الضربة القاضية dystroglycan (DgKO) الخلايا في DMEM-F12 تستكمل مع 2 ٪ FBS ، 0.01 ملغ / مل الأنسولين ، 0.005 ميكروغرام / مل EGF ، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين ، و 0.05 غرام / مل نورموسين.
  2. خلايا البذور DgKI عند 5000 خلية / سم2 ، وخلايا DgKO البذور عند 8000 خلية / سم2 بسبب الاختلافات في معدلات النمو. استزراع عند 37 درجة مئوية في حاضنات مرطبة مع تغيير الوسائط كل 2-3 أيام وممرات كل 4-5 أيام باستخدام تقنية معقمة صارمة. عد الخلايا بعناية باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلاياالآلي 27 لضمان معدلات النمو المناسبة.
  3. خلايا البذور لتحفيز اللامينين عند 10500 خلية / سم2 في أطباق البئر أو أطباق قاع الغطاء والاستزراع لمدة يومين ، باستخدام خلايا DgKI لتوليد خلايا كسورية Ln1 و DgKO كضوابط سلبية. قم بإذابة Ln-1 برفق طوال الليل على الثلج في الثلاجة ، ثم امزجه مع وسيط الحث DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين. بالنسبة لطبق 35 مم ، استخدم 1 مل من الوسائط الحثية مع 50-800 ميكروغرام من Ln1.
  4. في حالة استخدام الفلورسنت Ln1 ، امزج بنسبة 50: 1 بالوزن / الوزن.
  5. إزالة الوسائط من الخلايا ، وتغطيتها باللامينين والوسائط الحثية من DMEM-F12 المكمل ب 3 ميكروغرام / مل برولاكتين ، 2.8 ميكرومتر هيدروكورتيزون ، و 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين
  6. خلايا الثقافة لمدة 2 أيام ، ثم إصلاح مع 10 ٪ الفورمالين.

5. توصيف البنية المجهرية لللامينين عن طريق الفحص المجهري الضوئي

  1. اجمع عينات ثابتة واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  2. قم بحظر العينات واختراقها في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 ، و 3٪ ألبومين مصل بقري ، و 10٪ مصل ماعز ، و 40 ميكروغرام / مل شظية الأجسام المضادة المضادة للفأر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
    ملاحظة: Triton X-100 خطير. تعامل مع القفازات وحماية العين وتخلص منها بشكل مناسب.
  3. امزج الأجسام المضادة المضادة لللامينين بتخفيف 1: 100 مع 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA وأضفه إلى العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية في غرفة مرطبة (عادة ما تستخدم صناديق الأطراف مع مسح مختبر مبلل في الأسفل).
  4. قم بإزالة الأجسام المضادة الأولية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.
  5. أضف جسما مضادا ثانويا مناسبا بتخفيف 1: 500 إلى العينات في 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA واحتضانها في درجة حرارة الغرفة في الظلام في غرفة مرطبة.
  6. قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية واغسلها 3 مرات باستخدام 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA.
  7. بالنسبة للعينات التي تحتوي على خلايا ، أضف 6 ميكرومتر من القضيب لمدة 45 دقيقة ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS مع 0.5٪ Triton X-100 و 3٪ BSA ، متبوعا ب 3 غسلات مع PBS. ثم تلطخ ب 0.1 ميكروغرام / مل DAPI في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
  8. قم بتركيب العينات إذا كان ذلك مناسبا.
  9. هيكل الصورة ln-1 باستخدام المجهر متحد البؤر عالي الدقة. استخدم مجهر المسح بالليزر المجهز بأهداف الغمر (خطة الغمر في الماء Apochromat 40X / 1.1NA أو خطة الغمر بالزيت Apochromat 63X / 1.4NA).

6. توصيف تركيبات اللامينين عبر أبعاد عد الصناديق

  1. قم بتحليل خصائص الفركتلات باستخدام خوارزميات أبعاد عد الصناديق المتوفرة في صناديق أدوات Matlab أو في ImageJ. هذه الطرق عتبة صور laminin ورسم على سجل سجل رسم عدد المربعات التي تحتوي على Ln1 مقارنة بحجم الصناديق. ميل العلاقة بين هذه المعلمات هو بعد عد المربعات: سيكون للهندسة غير الفركتالية بعد 0 أو 1 أو 2 ، في حين أن الهندسة الكسورية لها بعد غير صحيح28.
    ملاحظة: المعالجة بالحمض والمعالجة بالبروتين السكري و DgKI المرتبطة بالخلايا Ln1 جميعها لها بعد كسورية عد الصناديق ~ 1.7 ، في حين أن التحكم Ln1 له بعد كسورية 2.0.

7. توصيف تركيبات اللامينين عن طريق المجهر الإلكتروني

  1. أعد تعليق الصفيحات في وسط زراعة الخلايا واتركها تمتص رقائق السيليكا لمدة 90 دقيقة في بيئة رطبة تبلغ 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح المصفوفات في 2.5٪ جلوتارالدهيد في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم العازلة عند درجة الحموضة 7.2.
    ملاحظة: الجلوتارالدهيد خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه كنفايات خطرة.
  3. مصفوفات Postfix في رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M عند الرقم الهيدروجيني 7.2.
    ملاحظة: رابع أكسيد الأوزميوم خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب. الكاكوديلات خطير ويجب التعامل معه في غطاء دخان مع قفازات وحماية للعين والتخلص منه بشكل مناسب.
  4. يغسل 3 مرات في المخزن المؤقت كاكوديلات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.2.
  5. يجفف مع زيادة تركيزات الإيثانول.
  6. رش مصفوفات معطف بطبقة رقيقة من الذهب.
  7. صورة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Laminin-111 هو بروتين ثلاثي مع ثلاثة مجالات ذاتية التجميع في نهاية أذرعه القصيرة (الشكل 1 أ). عند معالجتها بشكل مناسب ، يمكن أن تتبلمر الأذرع القصيرة إلى شبكة سداسية (الشكل 1ب ، 1 ج) ، والتي تعرض خصائص كسورية مجمعة محدودة الانتشار على نطاقات مكانية أكبر (الشكل 2). يشكل Laminin المحتضن في مخازن الأس الهيدروجيني المحايدة المحتوية على الكالسيوم مجاميع صغيرة مصورة بجسم مضاد مضاد ل Ln1 (الشكل 2A) ، والتي لها بعد كسورية مربع عد ~ 2 ، مما يشير إلى عدم وجود كسورية. في المقابل ، Ln1 المحتضنة في المخزن المؤقت pH4 المحتوي على الكالسيوم (الشكل 2B) ، أو في المخزن المؤقت المحايد مع nidogen-1 (الشكل 2C) تشكل شبكات لاسي تملأ الفضاء ببعد كسورية ~ 1.7 (الشكل 3). Ln1 المستزرع مع خلايا التعبير عن dystroglycan يشكل شبكات مزركشة مماثلة (الشكل 2D ، يظهر الجزء الداخلي نوى الخلية).

عندما يتم تصوير pH7Ln و polyLM باستخدام SEM بدقة متزايدة ، تصبح الاختلافات في البنية المجهرية أكثر وضوحا. عند الاستبانة المنخفضة (الشكل 2Ei و v) ، تظهر شبكات polyLM أكثر انتشارا مقارنة ب pH7-Ln ، وعند الدقة العالية ، تكون مجاميع pH7-Ln واضحة (الشكل 2E iv) بينما يمكن رؤية شبكة سداسية الانتشار في polyLM بدقة عالية (الشكل 2E viii).

Figure 1
الشكل 1: خلفية Ln1 وطريقة البلمرة: ج: Ln1 هو بروتين ثلاثي معقد مع مجالات لاصقة متعددة (لاحظت مواقع ربط المستقبلات) ، والتي يمكن أن تربط مجموعة متنوعة من مستقبلات الأنتغرين وغير الانتغرين (باللون الأسود) وتشكل شبكات بوليمرية عن طريق ربط ذراع قصير قصير الذراع (باللون الأسمر). B: يمكن أن يشكل Ln1 شبكة سداسية في وجود أيونات الكالسيوم وإما انخفاض درجة الحموضة أو البروتينات السكرية مثل nidogen-1 أو dystroglycan سطح الخلية. C: مثال على صورة SEM ل Ln1 المبلمرة تظهر الشبكة السداسية ونموذج التجميع Ln1 المقترح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: بيانات تمثيلية لبلمرة Ln1. ج: مجاميع Ln1 في مخازن محايدة مع الكالسيوم. عند تصورها باستخدام جسم مضاد مضاد ل Ln1 ، يمكن رؤية مجاميع صغيرة. B: Ln1 في الكالسيوم الحمضي المحتوي على بلمرة عازلة في polyLM ، مما يدل على خصائص كسورية. C: Ln1- خليط nidogen-1 (1: 1 بالوزن / الوزن) يشكل بوليمرات مماثلة. D: يظهر Ln1 في وسائط زراعة الخلايا المحايدة المخزنة المتراكبة على خلايا التعبير عن dystroglycan شبكة مزركشة مماثلة. أقحم: تلطيخ نووي مضاد يظهر مورفولوجيا الخلية. E: المسح المجهري الإلكتروني لشبكات pH7-Ln و polyLM (طريقة الدوران لأسفل) بدقة متزايدة. في pH7-Ln ، تظهر عمليات المسح منخفضة الدقة (i &ii) أليافا مضغوطة نسبيا ، والتي يتم حلها كمجاميع في عمليات المسح عالية الدقة (iii). polyLM في نفس التركيز هو أكثر انتشارا (iv &v) ، وتظهر عمليات المسح عالية الدقة شبكة سداسية تملأ الفضاء (vii). F: يتسبب هذا التغيير المجهري في تمايز الخلايا الظهارية للغدة الثديية DgKO وظيفيا إلى خلايا منتجة للحليب19. i: تظهر الخلايا المحفزة pH7-Ln ألياف إجهاد الأكتين الوفيرة (الحمراء) وغير المنظمة ZO-1 التي تحتوي على وصلات ضيقة (خضراء) ، بينما ii: تحتوي الخلايا المحفزة polyLM على أكتين خيطي أقل ، وتوطين جانبي للأكتين في حدود الخلية الخلوية و zo-1 منظم جيدا يحتوي على تقاطعات ضيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تقدير البعد الكسوري بطريقة عد الصندوق. A &B: تظهر الصورة الأولية ل pH7-Ln و polyLM اختلافات في التشكل. C&D: يتم تحديد عتبة هذه الصور لتؤدي إلى صورة بالأبيض والأسود ، E&F: ثم يتم حساب سجل نسبة عدد المربعات التي تحتوي على الصورة إلى حجم المربع. يمثل متوسط الميل بعد عد الصندوق الذي يتم حساب Fd. pH7-Ln له بعد مميز 2.0 ، مما يشير إلى عدم وجود خصائص كسورية ، في حين أن polyLM له بعد ~ 1.7 ، مما يدل على عملية تجميع محدودة الانتشار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تمثل اللامينين عنصرا أساسيا في ECM في أنظمة الأعضاء الظهارية والعضلية والعصبية ، وقد ثبت في المختبر أنها تلعب أدوارا أساسية في تنظيم التمايز الوظيفي للخلايا. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن بنية اللامينين المعروضة على الخلايا تنظم إشاراتها والنمط الظاهري للخليةالناتج 15،16 ، وبالتالي يجب أن تكون طرق التحكم في البنية المجهرية Ln1 ذات أهمية لعلماء الأحياء الأساسيين العاملين في هذه المجالات ، ولمهندسي الأنسجة الذين يسعون إلى تلخيص السلوك الطبيعي في المختبر. بشكل عام ، من المعروف أن البنية المجهرية لمجموعة متنوعة من بروتينات المصفوفة خارج الخلية تنظم الاستجابة البيولوجية وفهم الآليات التي تعدل بها البنية المجهرية وظيفة الخلية هي مجال نشط للبحث.

في هذا العمل ، نصف ثلاث طرق لبلمرة اللامينين في شبكات ذات بنية مجهرية كسورية مميزة للتجميع المحدود للانتشار. لقد ثبت أن بوليمرات Ln1 هذه تشير بشكل مختلف إلى الخلايا مقارنة ب Ln1 المجمعة ، ربما بسبب تغيير عرض المجال اللاصق للخلايا. قد تمثل هذه الطرق الثلاث للتحكم في البنية المجهرية Ln1 التكرار البيولوجي في تجميع Ln1 ، ولكن هذا يمثل تحديا للعمل التجريبي. إن التحكم في البنية المجهرية Ln1 باستخدام المعالجة العازلة الحمضية سيظهر التأثيرات فقط عند إضافته إلى خلايا الضربة القاضية dystroglycan19,20. وبالتالي ، يجب أن يأخذ التصميم التجريبي في الاعتبار الخلايا ونقاء Ln1 المراد استخدامه. عادة ما يتم اشتقاق Ln1 المتاح تجاريا من مصفوفة EHS ، والتي تحتوي على نسبة عالية من nidogens والبروتينات السكرية الأخرى. Ln1 في مصفوفة البيئة والصحة والسلامة يتبلمر بشكل صحيح في شبكات كسورية في أنظمة التخزين المؤقت المحايدة. أصبح Ln1 المؤتلف متاحا تجاريا مؤخرا ولكنه مكلف بشكل استثنائي.

تعد جودة بروتين Ln1 أمرا بالغ الأهمية لهذا العمل حيث يمكن لشظايا الذراع القصيرة أن تمنع البلمرة. تتداخل شظايا الذراع القصيرة (أي جزء E4) مع تكوين الشبكة حيث أن كل جزء يحدث فراغا في الشبكة29. تظهر البيانات السابقة أن إدراج شظايا E4 يمكن أن يمنع الأنماط الظاهرية المستحثة Ln129,30. وبالمثل ، وجدنا أن تكوين الشبكة يتعطل بسبب كميات صغيرة من laminin-332 (بيانات غير منشورة) ، والتي مثل شظايا E4 تحتوي على مجال لاصق واحد29,30. وبالتالي ، من الأهمية بمكان التحقق من أن Ln1 سليم ، ونقي للغاية لإزالة أنواع اللامينين الأخرى قبل بدء العمل.

في حين أن هذه الطرق ذات صلة بالباحثين الذين يدرسون تفاعلات مصفوفة الخلية ، تجدر الإشارة إلى أن عائلة اللامينين معقدة للغاية ، حيث تضم 15 عضوا معروفا ومتغيرات لصق إضافية31 ، وتتفاعل هذه العائلة مع مجموعة واسعة من المستقبلات والبروتينات السكرية والكولاجين وعوامل النمو المحتملة4. وبالتالي ، فإن Ln1 المبلمر يمثل حالة اختزالية يمكن توقع تعديلها بسرعة بواسطة وظيفة الخلية. علاوة على ذلك ، تستشعر أنظمة الأعضاء المختلفة اللامينين وتستجيب له وتعيد تشكيله بشكل مختلف: لقد أثبتنا أن ارتباط اللامينين بالأكتين من خلال الديستروغليكان يمكن الاستغناء عنه للغدة الثديية19 ، في حين أن الديستروغليكان ضروري للغاية لوظيفة الخلية العضلية32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تم تنفيذ هذا العمل تحت رعاية وزارة الطاقة الأمريكية من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني بموجب العقد DE-AC52-07NA27344. إصدار الدردشة LLNL-JRNL-799443.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل مختبر لورانس ليفرمور الوطني LDRD 18-ERD-062 (إلى CR). شكرا لجون موشلر على هديته الكريمة من خلايا DgKO و DgKI. شكرا للموظفين في مختبر المجهر الإلكتروني بجامعة كاليفورنيا بيركلي على المشورة والمساعدة في إعداد عينات المجهر الإلكتروني وجمع البيانات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% formalin Sigma Aldrich HT501128
Anti-Laminin primary antibody Sigma Aldrich L9393
Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody Thermo A32731
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
CaCl2 Sigma Aldrich C4901 or similar
Cell Culture Incubator Thermo Heracell 150 or similar
Centrifuge for microcentrifuge tubes Eppendorf 5418 or similar
Confocal Microscope Zeiss LSM 710 or equivalent
Coverslips Thermo 25CIR-1 or similar
DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red Thermo 11330107
EGF (Epidermal Growth Factor) Sigma Aldrich 11376454001
Fluorescently Labeled Laminin Cytoskeleton Inc LMN02
Gentamicin VWR VWRV0304-10G
Glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882
HCl Sigma Aldrich 320331 or similar
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0888-5G
Insulin Sigma Aldrich 16634-50mg
MepG Dystroglycan Knockout Cells LBNL N/A
NaOH Sigma Aldrich S8045 or similar
Normocin Invivogen ant-nr-1
Osmium Tetroxide Sigma Aldrich 75633
Ovine Prolactin Los Angeles Biomedical Research Institute Ovine Pituitary Prolactin
Phalloidin Thermo A22287
Phosphate Buffered Saline Thermo 10010023 or similar
Purified Laminin-111 Sigma Aldrich L2020-1MG
Recombinant human Nidogen-1, carrier free R&D systems 2570-ND-050
Sodium Acetate Sigma Aldrich S2889 or similar
Sodium Cacodylate Sigma Aldrich C0250
Sterile filters Millipore SLGP033RS or similar
Tris Sigma Aldrich 252859 or similar
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Ultra-low protein binding tubes VWR 76322-516, 76322-522 or similar
Ultrapure water Thermo 15230253 or similar

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  2. Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
  3. Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
  4. Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
  5. Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
  6. Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
  7. Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
  8. Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
  9. Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
  10. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  11. Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
  12. Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
  13. Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
  14. Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
  15. Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
  16. Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
  17. Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
  18. Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
  19. Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
  20. Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
  21. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  22. Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
  23. Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T. Polylaminin recognition by retinal cells. Journal of Neuroscience Research. 92 (1), 24-34 (2014).
  24. Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
  25. Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
  26. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
  27. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
  28. Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
  29. Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
  30. Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
  31. Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
  32. Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).

Tags

البنية المجهرية الكسورية ، Laminin-111 ، مصفوفة خارج الخلية ، Epithelia، العضلات ، الأنظمة العصبية ، تجميع Ln1 ، المجالات اللاصقة ، Ln1 المبلمرة
توليد بنية مجهرية كسورية من Laminin-111 للإشارة إلى الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hochman-Mendez, C., Coelho-Sampaio,… More

Hochman-Mendez, C., Coelho-Sampaio, T., Kent, A. J., Inman, J. L., Bissell, M. J., Robertson, C. Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells. J. Vis. Exp. (163), e61134, doi:10.3791/61134 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter