Ett protokoll för att utföra härstamning spårning och funktionell genetisk analys av kandidat gener på en enda cell nivå med mosaik analys med dubbla markörer (MADM) presenteras. MADM klonal analys ger en kvantitativ ram för att mäta proliferative beteende, cellulära produktion, och härstamning förhållandet mellan enskilda förfäder och deras dotter celler.
Från en begränsad pool av förfäder bildar däggdjursnahbarken mycket organiserade funktionella neurala kretsar. De underliggande cellulära och molekylära mekanismerna som reglerar härstamningsövergångar av neurala stamceller (NSCs) och eventuell produktion av nervceller och glia i det utvecklande neuropithelium är dock fortfarande oklart. Metoder för att spåra NSC-indelningsmönster och kartlägga härstamningen av klonalt relaterade celler har utvecklats dramatiskt. Men många samtida härstamning spårningsteknik lider av bristen på cellulär upplösning av avkomma cell öde, vilket är viktigt för att dechiffrera defader celldelning mönster. Presenteras är ett protokoll som använder mosaik analys med dubbla markörer (MADM) för att utföra in vivo klonal analys. MADM manipulerar samtidigt enskilda stamcellsceller och visualiserar exakta indelningsmönster och härstamningsprogression vid oöverträffad single cell-upplösning. MADM-baserade interchromosomal rekombination händelser under G2-X fasen av mitos, tillsammans med tidsmässigt inducible CreERT2, ge exakt information om födelsedatum kloner och deras division mönster. Madm-härstamningsspårning ger således oöverträffade kvalitativa och kvantitativa avläsningar av spridningssättet för stamceller på encellig nivå. MADM möjliggör också undersökning av mekanismerna och funktionskraven hos kandidatgener i NSC-härstamningsprogression. Denna metod är unik genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Här beskrivs protokollet i detalj, och experimentella paradigm att använda MADM för klonal analys och härstamning spårning i den växande hjärnbarken demonstreras. Viktigt, detta protokoll kan anpassas för att utföra MADM klonal analys i någon murine stamceller nisch, så länge CreERT2 föraren är närvarande.
Hjärnbarken är en mycket organiserad struktur som består av sex distinkta lager. Cortex innehåller ett varierat utbud av celltyper inklusive nervceller och glia, som interagerar för att bilda funktionella neurala kretsar. De flesta, om inte alla, när excitatoriska projektion nervceller och glia härrör från en gemensam pool av neurala stamceller (NSCs) kallas radiella glia (RGPs)1,2,3. RGPs själva härrör från neuroepithelial stamceller (NESCs) komponera tidiga embryonala neuropithelium. Vid embryonal dag 9 (E9) hos möss börjar NESC att övergå till RGPs4. RGP härstamning progression kräver exakt tidsmässiga och rumsliga reglering, och när denna process hindras, allvarliga neurologiska sjukdomar såsom megalencephaly, mikrocefali, lissencephaly, eller nedskrivningar såsom schizofreni och autism kan resultera5,6. Vid E10, de flesta RGPs genomgår symmetriska proliferative divisioner, vilket resulterar i en expansion av neurala stamfaderpoolen4,7. RGPs börjar så småningom att dela asymmetriskt, producerar när projektion nervceller på ett tidsmässigt definierade sätt. Genom på varandra följande vågor av neurogenes, nyfödda nervceller migrera in i när plattan bildar när laminae med tidiga födda nervceller ockuperar djupa lager och sena födda nervceller som bor i de ytliga skikten8,9,10. Eftersom clonally relaterade pyramidala nervceller migrera radiellt i hjärnbarken med mycket lite tangentiell spridning, dotterceller tenderar att bilda en kolumn eller konformad struktur som kallas en neuronal radial enhet4,11,12,13. Genom E17 är embryonal neurogen expansion klar hos möss14. RGPs kan också producera ependymala celler och vissa klasser av glia, inklusive astrocyter och oligodendrocyter1,15,16,17,18,19. Potentialen för RGPs att ge upphov till både nervceller och astrocyter verkar vara konsekvent i alla när regioner18, med cirka 1/6 av neurogena RGPs också producerar glia11.
För närvarande är de genetiska och epigenetiska faktorer som reglerar tidsmässiga progression av en stamceller längs dess härstamning mestadels okända. Tidsmässiga mönster av genuttryck kan ha betydande inverkan på härstamningsbeslut i RGPs20,,21,22,,23,24. Hur detta tätt stickade förhållandet mellan tidsmässiga och rumsliga mönster leder till den molekylära mångfalden av vuxna neuronala typer över när områden är inte känt. På samma sätt är hur den enskilda stamcellspotentialen och dess cellulära utgång moduleras på cell- och molekylär nivå en viktig obesvarad fråga. Framtida studier kommer förhoppningsvis att ta upp några av dessa frågor, i slutändan utöka vår förståelse av funktionella när kretsbildning.
Utvecklingsneurobiologi syftar till att förstå den härstamning relation som celler i hjärnan delar med varandra. Inledningsvis var mycket få forskningsverktyg tillgängliga för detta, och många tidiga studier förlitade sig på visuella observationer av division mönster i transparenta organismer som Caenorhabditis elegans25. De senaste decennierna har sett en dramatisk ökning av antalet och förfining av tekniker tillgängliga13,26,27,28,29. Framväxten av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystem möjliggör syntetisk rekonstruktion av cellhärstamning relationer genom att införa utvecklas DNA streckkoder27,30. Två aktuella exempel på barcoding strategier är användningen av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 till specifika DNA-streckkod lokus eller en cytidin deaminase smält med nickase Cas9 att rikta endogena varvas upprepade regioner31,32. Dessa tekniker ger mycket multiplexerade metoder genom införandet av streckkoder som successivt och stabilt ackumulera unika mutationer över tiden. Genomredigeringsmetoder är mycket värdefulla eftersom de tillåter retroaktiv analys av förhållandet mellan två celler baserat på det delade arvet av dessa streckkoder. Men för att läsa streckkoderna i enskilda celler måste vävnaden vanligtvis störas, och därför går information om position, morfologi och absoluta cellnummer från en enskild stamfader förlorad.
Kombinatoriska märkningsparadigmer bevarar rumslig information och möjliggör i princip också skillnaden mellan nära lokaliserade eller till och med överlappande kloner33,34. För att en härstamningsspårningsmetod skall vara informativ skall den märka enskilda stamfader och deras avkomma på ett glest och outplånligt sätt. Noterbart är att Brainbow35 och Confetti36,37 metoder använder stokastiska multicolor Cre recombinase-baserade reportrar som uttrycker en kombination av fluorescerande proteiner från en enda locus. Det omfattande antalet samtidiga färgkombinationer som kan uppnås in vivo gör detta till ett kraftfullt verktyg när man spårar när RGP-kloner och astrocyter34. Transposon-baserade system som ger stabil genomisk integration av transgener kodning fluorescerande reportrar och tillåter härstamning spårning av när defagenitorer har också utvecklats33,,38,,39,40,41. Transposon-baserade system har en extra fördel i att reportern konstruerar stabilt integrera i genomet, och därmed tillförlitligt etikett lineally relaterade dotterceller. För att spåra astrocyt härstamningar specifikt, ett antal metoder har utvecklats som innebär elektroporation av piggyBac transposaser inklusive Star Track, som använder sig av en kombination av konstruktioner kodning olika fluorescerande proteiner40,42. Ett annat tillvägagångssätt, MAGIC markörer, introducerar Brainbow vektorer som transponerbara transgener. Detta har framgångsrikt använts för att spåra embryonala neurala och astrocytprogenitors34,,43. Nyligen, mosaik analys av dubbla recombinase-medierad kassett utbyte (MADR) befanns stabilt märka mutanta celler uttrycker transgena element från exakt definierade kromosomal loci44. Dessa kraftfulla in vivo kombinatoriska märkning tekniker har gett många insikter i härstamning dynamiken i stamcellsceller. Dessa analyser utförs dock på fast vävnad, vilket ger en ögonblicksbild av enskilda kloner i ett definierat utvecklingsstadium. För att observera förändringar i härstamningsdynamiken hos enstaka kloner över tiden måste kroniska in vivo-avbildningsmetoder som liknar dem som utförs i den vuxna dentatentategiken appliceras45.
Mosaikanalys med dubbla markörer (MADM) är en kraftfull dubbel färgmärkningsmetod som möjliggör in vivo-härstamningsspårning av enskilda stamcellsceller hos möss46,47. Två komponenter är nödvändiga för madm-märkningshändelser: För det första måste MADM-kassetter riktas mot identiska loci på homologa kromosomer. Kassetter består av två chimärlyssiga reportergener, eGFP (grön, [G]) och tandemdimmer Tomat (röd, tdT[T]). GT-kassetten innehåller N-ändstationen för eGFP och C-ändstationen för tdT, åtskilda av en intron som innehåller en loxP-plats. GT TG-kassetten är konstruerad omvänt, med N-ändstationen av tdT och C-ändstationen för eGFP. För det andra är uttrycket av Cre recombinase i samma cell som innehåller riktade MADM kassetter viktigt. I avsaknad av Cre,chimerkassetter inte uttrycka funktionella eGFP eller TDT eftersom deras kodning sekvenser störs. LoxP-platserna fungerar som mål för Cre-medierad interchromosomal rekombination, vilket resulterar i rekonstituering av båda uttryckskassetter samtidigt. Om rekombination inträffar under G2-fasen av cellcykeln följt av X-segregering (G2-X), kommer de två dottercellerna att uttrycka var och en av de två fluorescerande proteinerna. Temporal reglering av CreERT2 verksamhet med tamoxifen (TM) ger exakt information om födelsedatum MADM kloner och division mönster av deras avkomma(Figur 1A)29,46,47.
MADM kan potentiellt systematiskt märka enskilda kloner med hög encellig upplösning i mushjärna som liknar traditionella men ospecificerade och mödosamma metoder som Golgi färgning48 eller färgfyllning49. Eftersom endast promotorn kör CreERT2 bestämmer celltyp specificitet klonala MADM märkning, MADM kan i princip tillämpas för klonala härstamning spårning i alla murine organ och vävnad47,50,51,52. I själva verket har studier redan använt MADM för att avslöja härstamning relationer i kloner som härrör från olika vävnader47,50,,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentella paradigm har tillämpats för att studera härstamning i när projektion nervceller, glia, och postnatala stamceller i utvecklingen neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har också använts för att studera cell härstamning i den vuxna dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulat celler och interneurons på klonal nivå (se tabell 1 för en komplett lista)47,53,,54,,56,,57,66.
Ett unikt inslag i MADM är förmågan att genetiskt länka mutationer distala till en MADM kassett, vilket skapar en genetisk mosaik (figur 1B och figur 2). Detta resulterar i vilda dotterceller märkta med en fluorescerande markör (tdT i figur 1B) och homozygous mutant syskon med den andra (eGFP i figur 1B) i en omärkt heterozygous miljö. MADM är unikt genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Ursprungligen var MADM kassetter riktade i Rosa26 locus47, men MADM analys av genfunktion var begränsad till gener distala till locus. För att övervinna (åtminstone delvis) denna begränsning och utöka möjligheterna för MADM-baserade genanalyser, MADM kassetter slogs i nära centromeres av Chr. 751, Chr. 1146, och Chr. 1251. Inriktning alla 19 mus autosomes med MADM kassetter pågår och kommer att möjliggöra praktiskt taget alla gener som skall studeras i framtiden, vilket ger en oöverträffad plattform för studier av utvecklingsmässiga härstamning relationer i kombination med funktionell genetisk analys.
En metod för att använda MADM för att spåra cell härstamning av enskilda RGPs in vivo i utvecklingen neocortex beskrivs. I kombination med TM-inducible CreERT2kan MADM-händelser tidsinställas exakt, vilket ger en mycket kvalitativ och kvantitativ visuell avläsning av stamcellsdelningsmönster på cellnivå. Genom att titrera dosen av levererad TM kan i en idealisk situation erhållas i genomsnitt mindre än en klon per kortikal halvklot, vilket ger tillräcklig rumslig separation för att entydigt skilja enskilda kloner. Genom att upprätthålla vävnadsintegritet fångar denna metod också viktig information om position, morfologi och absoluta cellnummer. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, och den ursprungliga MADM på Rosa2647,53,59 har använts i MADM klonala analysstudier. Den högupplösta enskilda celler ger oöverträffad inblick i både morfologi och klonala förhållandet mellan dotterceller och tillåter levande bildbehandling av växande stamceller och nya kloner46,52.
Kejsarsnitt och främjande av valpar för analys av kloner vid postnatala tidspunkter är ett nödvändigt och kritiskt steg i protokollet. Beroende på hälsotillståndet för den TM-behandlade gravida dammen, det kanske inte är nödvändigt att utföra ett kejsarsnitt. Hur … än, höja den pups med en utveckla moder är stilla krevad, emydslig den TM- behandlat moder Maj har oroa ammande. Inga skillnader har observerats i behovet av att främja med olika CreERT2 förare. Både MADM linjer och fostermödrar upprätthålls på en outbred CD-1 bakgrund. Om kejsarsnitt inte är nödvändigt kan den TM-behandlade dräktiga dammen som används för att generera experimentella ungar återanvändas för ytterligare experimentella avel i enlighet med principerna i 3R (observera att detta endast kan göras om djurförsökslicenser godkänner denna praxis). Fostermödrar kan användas för att främja ungar inom 2 dagar efter att de föder, men högre framgång har observerats när fostermödrar föder samma dag som de experimentella möss som måste främjas. Därför är det viktigt att ställa in tidsinställda parningar för fostermödrar parallellt med experimentella parningar i steg 1.1. Upprätthållande en lik skräp antal så den original utveckla moder’ skräp kanna förbättra överlevnaden hastigheten av främjat pups, och därför flyttanden något till all om original skräp Maj bli nödvändig. Ytterligare åtgärder som kan förbättra fosterhem inkluderar gnugga experimentörens handskar med skräp och mat (för att ta bort doften av handskarna); gnugga ungarna försiktigt efter kejsarsnittet med fragment av fostermoderns smutsiga kull och bo; och placering av valparna i nära kontakt med fostermoderns valpar innan de placering i fostermusburen.
Liksom i andra reporter-baserade härstamning spårningsmetoder, måste noggrann hänsyn tas när man väljer den optimala CreERT2 föraren för MADM klonala experiment. För det första måste den promotor som används uttrycka rekombinationen både tidsmässigt och rumsligt i föregångaren av intresse. Att hitta denna promotor kan vara en utmaning, eftersom vissa initiativtagare kan ändra uttrycksmönster eller tystas i olika utvecklingsstadier. För att förbättra celltyps specificitet har flera platsspecifika rekombinationer, som var och en drivs av separata promotorer, använts. När en eller båda rekombiner uttrycks i samma cell, detta etiketter cellen och dess avkomma med en fluorescerande reporter74,75,76,77. Sammanfattningsvis är det viktigt att välja en CreERT2-förare som är specifik för populationen av stamfader som analyseras.
Det mest kritiska steget i den här metoden är identifieringen av en klon, eftersom alla celler måste härledas entydigt från en enda rekombinationshändelse (steg 8.1). Titrering av TM-koncentration säkerställer mindre än ett kluster av röda/gröna celler per hjärnhalvklot och maximerar sannolikheten för att analysera en enda klon (steg 2.2)7,11. Kloner bör kasseras om angränsande cellkluster förekommer inom 500 μm från klonen av intresse. Därför är det viktigt att undersöka flera avsnitt före och efter utseendet på en klon för att säkerställa att det inte finns några ytterligare rekombination händelser i närheten. På grund av svagare signal av fluorofores, är det nödvändigt att utföra immunohistochemistry för eGFP och tdT i embryonala kloner (se avsnitt 6). Detta rekommenderas endast i vuxna kloner om ytterligare antigener kommer att kollidera. Vid bildframställning kloner, är det viktigt att fånga hela bredden av cortex där klonen är belägen (dvs. från pial yta till corpus callosum; se steg 8.4) för att inte missa några celler. Detta underlättar också bildjustering under bildbehandling (avsnitt 9). Avsnitt 8 i protokollet kräver ett inverterat konfokalmikroskop men kan anpassas beroende på vilken mikroskopinställning som finns tillgänglig. Epifluorescensmikroskopi kan användas, men konfokalmikroskopi rekommenderas eftersom detta leder till en minskning av ljuskontaminering från utanför fokusplanet. Det är också viktigt att laserintensiteten och förstärkningen justeras så att gröna, röda och gula celler otvetydigt kan identifieras. Oavsett inställning rekommenderas att använda ett mål på minst 20x för att säkerställa fullständig rumslig separation av nära placerade celler. Förutom att registrera det kortikala djupet av alla celler (steg 8.6) måste när regioner där klonerna finns identifieras med hjälp av en hjärnatlas som Allen Brain atlas eller andra stereotaxiska koordinatkartor. En fil namngivning paradigm bör också antas för att se klon bilder är lätta att identifiera. Följande information kan ingå i filnamngivningen: unikt bild-ID, datumbild togs, genotyp av djur, induktionsåldern, analysålder, bildnummer i förhållande till resten av bilderna från samma klon.
Införandet av en mutation distala till en MADM kassett distinkt tillåter generering av genetiska mosaiker71 och tillåter dissekering av molekylära regulatorer av härstamning och cell typ mångfald på klonal nivå7,11,46,62. För att skapa en genetisk mosaik med MADM måste MADM-kassetterna vara meiotiskt kopplade till samma kromosom som den gen av intresse (se figur 2 för avelsprogram). Detta begränsar den aktuella kloniska analysen med MADM till gener som finns på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251, och Chr. 6 distala till Rosa26 locus47. Framtida studier kommer att använda MADM kassetter riktade till alla kromosomer, vilket möjliggör mosaik analys av praktiskt taget alla gener av musgenomet på klonal nivå.
Slutligen är MADM inte begränsat till analys av stamcellsceller i den utvecklande neocortexen. Studien av många stamceller nischer skulle kunna dra nytta av förmågan att lösa spatiotemporal arrangemang av clonally relaterade celler. Genom att tillämpa MADM på andra regioner i hjärnan, sjukdomstillstånd (t.ex. cancer) eller i andra vävnader47,,50,,51,,52,,53,54,,55,,56,57,58,59, visade studier härstamningsförhållanden hos kloner som härrör från olika klasser av progenitor och stamceller (se tabell 1 för aktuell lista över MADM-klonala studier). En annan intressant framtida tillämpning av MADM är att kombinera det med ytterligare funktionella eller subcellulära reportrar, vilket skulle öka graden av information som kan förvärvas från kloner.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar i Hippenmeyer laboratoriet för diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility, och prekliniska Anläggningen vid IST Österrike för teknisk support. Detta arbete stöddes av IST Austria institutionella fonder; R.B. fick stöd från Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A fick stöd från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fick stöd från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtalet marie skłodowska-curie som beviljas av ISTplus som postdoktor. A.H. fick stöd från en ÖAW DOC (Doktorandstipendium vid Den österrikiska vetenskapsakademin). Denna studie stöddes också av Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 725780 LinPro) till S.H.
1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 9204512N | |
1,4-diazabicyclooctane (DABCO) | Roth | 0718.2 | |
10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock) | Braun | 8508429N | |
15 mL conical centrifuge | Sarstedt | 65.554.502 | |
24 multi-well dishes | Roth/Greiner Bio-one | CE56.1 | |
27- gauge x 3/4 needle (Sterican) | Braun | 16010256E | |
Corn oil | Sigma | C8267-500ML | |
Coverslips (24 x 60 mm #1) | Thermo Fisher Scientific (Menzel) | 15747592 | |
Cryostat Cryostar NX70 | Thermo Fisher Scientific | 957000H | |
Dako Pen (Wax marker) | Agilent | S200230-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
Disposable microtome blade (MX35 Ultra) | Thermo Fisher Scientific | 705830 | |
Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
Glass anti-roll plate | Histocom | M 449980 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
LSM 800 Confocal | Zeiss | ||
Mounting medium | 25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) | ||
Mowiol 4-88 | Roth | 0713.2 | |
Normal donkey serum | Innovative Research | IGDNSER100ML | |
Paraformaldehyde | Sigma | 441244-1KG | |
Peristaltic pump 323E/D 400RPM | Watson-Marlow | 036.3124.00A | |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | |
Superfrost plus glass slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNT | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Tissue Embedding mold T-12 (22mm square) | Polysciences Inc. | 18986-1 | |
Tissue-Tek O.C.T | Sakura | 4583 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Trizma hydrochloride | Sigma | 93363 | |
Tween-20 | Sigma | P9416-100ML | |
Software and Plugins: | |||
Fiji | 1.52p | Fiji | |
MultiStackReg | 1.45 | Download link | |
TurboReg | EPFL Bioimaging | ||
Zen Blue | 2.6 | Zeiss | |
Experimental Models: Organisms/Strains: | |||
Mouse: Emx1-CreER | The Jackson Laboratory | JAX:027784 | |
Mouse: MADM-11-GT | The Jackson Laboratory | JAX:013749 | |
Mouse: MADM-11-TG | The Jackson Laboratory | JAX:013751 | |
Primary antibodies: | |||
Chicken anti-GFP 1:500 | Aves Labs | GFP-1020 | |
Goat anti-tdTomato 1:500 | Sicgen Antibodies | AB8181-200 | |
Rabbit anti-RFP 1:500 | MBL | PM005 | |
Secondary antibodies: | |||
Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500 | Jackson Immuno Research | 715-475-150 | |
Donkey Anti-Goat Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | |
Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500 | Jackson Immuno Research | 711-165-152 |