Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation
Summary
Es wurde eine Methode entwickelt, keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen, die es Forschern ermöglicht, zu bewerten, wie einzelne mikrobielle Arten oder mikrobielle Gemeinschaften mit mehreren Arten auf Kohlblattoberflächen interagieren. Es wird auch ein steriler Pflanzenextrakt präsentiert, der zur Messung von Verschiebungen in der Zusammensetzung der Gemeinschaft während der Gemüsegärung verwendet werden kann.
Abstract
Die Phyllosphäre, der oberirdische Teil der Pflanze, der von Mikroben besiedelt werden kann, ist ein nützliches Modellsystem, um Prozesse der mikrobiellen Gemeinschaftsmontage zu identifizieren. Dieses Protokoll skizziert ein System zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre von Napa-Kohlpflanzen. Es beschreibt, wie keimfreie Pflanzen in Reagenzgläsern mit einem kalzinierten Ton- und Nährboden anwachsen. Die Impfung von keimfreien Pflanzen mit spezifischen mikrobiellen Kulturen bietet Möglichkeiten, das mikrobielle Wachstum und die Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre zu messen. Durch die Verwendung von sterilem Pflanzenextrakt aus Kohl können auch Verschiebungen in mikrobiellen Gemeinschaften, die während der Fermentation auftreten, bewertet werden. Dieses System ist relativ einfach und kostengünstig im Labor einzurichten und kann verwendet werden, um wichtige ökologische Fragen in der mikrobiellen Gemeinschaftsversammlung zu behandeln. Es bietet auch Möglichkeiten zu verstehen, wie die Zusammensetzung der Phyllosphärengemeinschaft die mikrobielle Vielfalt und Qualität der pflanzlichen Fermentationen beeinflussen kann. Dieser Ansatz zur Entwicklung von gnotobiotischen Kohlphyllosphärengemeinschaften könnte auf andere wilde und landwirtschaftliche Pflanzenarten angewendet werden.
Introduction
Die mikrobielle Vielfalt der Phyllosphäre spielt eine wichtige Rolle bei der Erhaltung der Pflanzengesundheit und kann auch die Fähigkeit von Pflanzen beeinflussen, Umweltbelastungen zu widerstehen1,2,3,4,5. Die Gesundheit der Kulturen wiederum wirkt sich direkt auf die Lebensmittelsicherheit und die Qualität6,7aus. Pflanzen spielen eine Rolle bei der Funktionsweise des Ökosystems und die damit verbundenen Mikrobiome beeinflussen sowohl die Fähigkeit der Pflanzen, diese Aktivitäten durchzuführen, als auch die Umwelt selbst direkt zu beeinflussen8. Während Wissenschaftler begonnen haben, die Funktion und Zusammensetzung der Phyllosphäre zu entschlüsseln, werden die ökologischen Prozesse, die die mikrobielle Gemeinschaft der Phyllosphäre beeinflussen, nicht vollständig verstanden9,10. Das Phyllosphärenmikrobiom ist ein ausgezeichnetes experimentelles System zur Erforschung der Ökologie von Mikrobiomen11. Diese Communities sind relativ einfach und viele der Community-Mitglieder können auf Standard-Labormedien10,12,13angebaut werden.
Fermentiertes Gemüse ist ein System, bei dem die Gemeinschaftsstruktur der Phyllosphäre wichtige Folgen hat. Sowohl im Sauerkraut als auch in der Kimchi dienen die Mikroben, die natürlicherweise auf gemüseblättern (der Phyllosphäre der Brassica-Arten) vorkommen, als Inokulum für die Fermentation14,15. Milchsäurebakterien (LAB) gelten als allgegenwärtige Mitglieder pflanzlicher Mikrobiome, können aber in der Phyllosphäre16in geringem Überfluss vorhanden sein. Starke abiotische Selektion während der Fermentation treibt eine Verschiebung der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung, die es Milchsäurebakterien ermöglicht, in Hülle und Fülle zu zunehmen. Während LAB wächst, produzieren sie Milchsäure, die die saure Umgebung von fermentierten pflanzlichen Produkten17 schafft. Die Verbindung zwischen phyllosphere und ferment bietet die Möglichkeit, Gemüse als Modell zu verwenden, um zu verstehen, wie Mikrobiome strukturiert sind.
Wir haben Methoden entwickelt, um keimfreie Napa-Kohlsorten anzubauen und sie mit speziellen mikrobiellen Gemeinschaften mit Sprühflaschen zu impfen. Dies ist eine kostengünstige und zuverlässige Methode, um den Kohl gleichmäßig mit einzelnen Mikroben oder gemischten Gemeinschaften zu impfen. Ein steriler Gemüseextrakt (SVE) wurde auch aus drei verschiedenen Kohlsorten/Sorten entwickelt: Rot- und Grünkohl (Brassica oleracea) und Napa Kohl (B. rapa). Die Zugabe von Salz zu diesen SVEs repliziert die Fermentationsumgebung und ermöglicht kleine und relativ hochdurchsatzige experimentelle Studien der Fermentationsmikrobiom-Montage. Diese Methoden können verwendet werden, um die mikrobielle Gemeinschaftsmontage in der Phyllosphäre zu untersuchen und wie die mikrobielle Gemeinschaftsdynamik in der Phyllosphäre mit dem Erfolg der pflanzlichen Fermentation in Verbindung gebracht werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Keimfreie Napa-Kohlpflanzen wurden verwendet, um die Dispersionsbeschränkung von Milchsäurebakterien in der Napa Kohlphyllosphäre17zu untersuchen. Keimfreie Napa-Kohlsorten können auch verwendet werden, um individuelles oder paarweises Wachstum in der Phyllosphäre zu testen (Abbildung 1). Methoden zur Herstellung von sterilem Pflanzenextrakt wurden für drei verschiedene Kohlsorten getestet: Rot, Grün und Napa. Jede dieser SVE fungiert als zuverlässiges Wachstu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den USDA-NIFA-Zuschuss unterstützt: 2017-67013-26520. Tracy Debenport und Claire Fogan leisteten technische Unterstützung und Ruby Ye und Casey Cosetta gaben hilfreiche Kommentare zu frühen Versionen dieses Manuskripts.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 20170-650 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 7-way tray tray | Sigma Magenta | T8654 | |
| Amber Round Boston Glass Bottle | GPS 712OZSPPK12BR | Ordered on Amazon.com from various suppliers | |
| Basket coffee filters | If you care | (unbleached paper) Purchased from Wholefoods | |
| Bleach (mercury-free) | Austin's | 50-010-45 | |
| Borosilicate Glass tubes | VWR | 47729-586 | |
| Calcined clay | Turface | MVP | Ordered on Amazon.com from Root Naturally 6 Quart Bags. Particle size approximately 3-5 mm |
| Cuisinart blender | Cuisinart | Cuisinart Mini-Prep Plus Food Processor, 3-Cup | |
| Dissection scissors | 7-389-A | American Educational Products | Ordered on Amazon.com |
| Ethanol | VWR | 89125-172 | |
| Forceps | Aven | 18434 | Ordered on Amazon.com |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| KleenGuard M10 | Kimberley-Clark | 64240 | |
| Large plastic container | Rubbermaid | Ordered on Amazon.com | |
| Light racks | Gardner's Supply | 39-357 | full-spectrum T5 fluorescent bulbs |
| Magenta tm 2-way caps | Millipore Sigma | C1934 | |
| Man, Rogosa, and Sharpe | Fisher Scientific | DF0881-17-5 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | |
| Micropestle | Carolina | 215828 | Also called Pellet Pestle |
| MS nutrient broth | Millipore Sigma | M5519 | Murashige and Skoog Basal Medium |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| Napa cabbage seeds | Johnny's Select Seeds | 2814G | B. rapa var pekinensis (Bilko) |
| Petri dish 100 mm x 15 mm | Fisher | FB0875712 | Used to make agar plates |
| Phosphate buffer saline | Fisher Scientific | 50-842-941 | Teknova |
| Plant tissue culture box | Sigma | Magenta GA-7 | |
| Serologial pipettes | VWR | 89130-900 | |
| Sterile dowel | Puritan | 10805-018 | Autoclave before use to sterilize |
| Sterilizing 0.2 µm filter | Nalgene | 974103 | |
| Tryptic soy agar | Fisher Scientific | DF0370-17-3 | This media is for broth and 15 g of agar is added to make plates |
| Wide orifice pipette tips | Rainin | 17007102 | |
| Yeast, peptone and dextrose | Fisher Scientific | DF0428-17-5 | This media is suitable but media can also be made using yeast, peptone and dextrose, add 15 g of agar when making plates |
References
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