Первичные реснички являются внеклеточными структурами, связанными с центриолом. Первичное обнаружение ресничок с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания является относительно простой процедурой, которая приводит к чрезвычайно высококачественным изображениям. В этом протоколе фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Простое обнаружение первичной силии с помощью иммунофлуоресценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Первичные реснички динамически регулируются во время прогрессирования клеточного цикла, особенно во время фаз G0/G1 клеточного цикла, ресорбируются до митоза. Первичные реснички можно визуализировать с помощью очень сложных методов, включая электронную микроскопию передачи, 3D-изображение или программное обеспечение для автоматического обнаружения первичных ресничок. Тем не менее, иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок необходимо для выполнения этих методов. Эта публикация описывает протокол для легкого обнаружения первичных ресничок in vitro путем окрашивания ацетилированного альфа-тубулина (аксонема) и гамма-тубулина (базального тела). Этот иммунофлюоресцентный протокол окрашивания относительно прост и приводит к высококачественным изображениям. В настоящем протоколе описывается, как четыре клеточные линии (C2C12, MEF, NHLF и фибробласты кожи), выражают первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены флуоресцентным или конфокальные микроскопы.
Введение
Первичные реснички сенсорные, одиночные, мембранные, немотильные структуры, связанные с матери центриоля клетки. Первичные реснички находятся на большинстве позвоночных клеток, за исключением красных кровяных телец,адипоцитов 1, и гепатоцитов2. Первичные реснички образуются как удлиненный аксонем, состоящий из микротрубочек, основным компонентом которых является З-тубулин. Аксонем растет из базального тела, которое структурировано из З-тубулина. Длина первичных ресничок колеблется от 2 до 10 мкм; однако, его размеры могут меняться во время гликилирования, голодания, гипоксии, цитотоксического стресса, или после воздейств....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка культурных средств массовой информации, решений и блюд
- Автоклав крышки (22 х 22 мм). Приготовьте 6 хорошо пластин. Оттепель плода бычьей сыворотки (FBS) и антибиотик пенициллин / стрептомицин и тепло культуры средней до комнатной температуры (RT). Использование трипсина-ЭДТА (0.25%) и 1x PBS (фосфат буферный солевой раствор с кальцием и магнием) для прохождения клеток.
- Приготовьте свежий 4% параформальдегид (PFA) в dH2O (800 мг ПФА в 20 мл dH2O). PFA должен быть только что подготовлен к каждому эксперименту. Перемешать и нагреть раствор при температуре 55 градусов по Цельсию в течение 30 минут в капюшоне. Охладит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Иммунофлуоресцентное окрашивание первичных ресничок является относительно простой процедурой, которая приводит к высококачественным изображениям. В этих экспериментах фибробласты, выражаюющие первичные реснички, были зафиксированы, ослаблены иммунитетом и изображены в флуоресцентном или конфокальцаторном микроскопе в соответствии с описанным выше протоколом. Первичный цилий был обнаружен с помощью ацетилированного З-тубулина и З-тубулина. Оценка первичных ресничок может проводиться на различных уровнях, и любое изменение.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Некоторые авторы описали различные методы обнаружения первичных ресничок, иногда также описывая различные методы фиксации, которые могут повлиять на их обнаружение6,,20,,21,22. Несмотря на это, трудно найти полный и простой протокол для обнаружения. Наличие такого метода, несомненно, будет иметь большую помощь в изучении первичного исследования ресничок, особенно на ранних стадиях исследований,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечегораскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Министерством обороны Чешской Республики - Долгосрочный план развития организации Медицинские аспекты оружия массового уничтожения факультета военных медицинских наук, Университет обороны; Министерство образования, молодежи и спорта Чешской Республики (Специальный исследовательский проект No: СВ/ ФВЗ201703) и ПРОГРЕС No40/06. Спасибо также Даниэлю Диасу за его добрую помощь в пересмотре английского языка.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 6-луночный планшет | TPP | 92406 | Размеры 128x86x22 мм |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab')? Фрагмент козьего антикроличьего IgG |
| антитубулина &гамма; | Sigma-Aldrich | T5192 | Поликлональный кролик против мыши IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Миобласт (мышь) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Антимышиный IgG (цельная молекула) F(ab′)2 фрагмент; Антитело Cy3, полученное у овец |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-фенилиндола дигидрохлорид) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´ s Модифицированный Eagle´ Среда | Thermo Scientific | 11960044 | высоким содержанием глюкозы, без глутамина, Gibco |
| Dulbecco' s Фосфатно-солевой буферный раствор | Sigma-Aldrich | D8662 | с MgCl2 и CaCl2, стерильно отфильтрованный, подходит для клеточной культуры |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo Scientific | 16000044 | стерильно отфильтрованная, Gibco |
| L-глутамин | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF ATCC | SCRC-1039 | Мышиный эмбриональный фибробласт | |
| Моноклональный антиацетилированный тубулин | Sigma-Aldrich | T7451 | Моноклональное антиацетилированное антитело к тубулину, полученное у мышей |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Первичные фибробласты легких (человек) |
| Нормальная козья сыворотка | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | 158127-500G | порошок |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma-Aldrich | P0781 | 10 000 единиц пенициллина и 10 мг стрептомицина на мл в 0,9% NaCl, стерильно-фильтрованный |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Фибробласты кожи | любезно подарены Карловым университетом, медицинским факультетом в Градце Крá lové. | ||
| Квадратная крышка | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Боросиликатное стекло, 22x22мм, квадратная |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| трипсин-ЭДТА (0.25%) | Thermo Scientific | 25200072 | стерильно-фильтрованный, Gibco |
Ссылки
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
