إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد نموذج مُنَقَر vivo السابقين من التهاب القرنية البكتيري. يستخدم Pseudomonas aeruginosa ككائن اضروبي. هذا النموذج المبتكر يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية.
Abstract
عند تطوير مضادات الميكروبات الجديدة ، يعتمد نجاح التجارب الحيوانية على استقراء دقيق لنجاعة مضادات الميكروبات من الاختبارات المختبرية إلى العدوى الحيوانية في الجسم الحي. وعادة ما تبالغ الاختبارات المختبرية الموجودة في تقدير فعالية مضادات الميكروبات لأن وجود الأنسجة المضيفة كحاجز للنشر لا يُحَدَّد. للتغلب على هذا عنق الزجاجة، قمنا بتطوير نموذج القرنية السابق vivo porecine من التهاب القرنية البكتيري باستخدام Pseudomonas aeruginosa ككائن حي نموذجي. توضح هذه المقالة إعداد القرنية بورسين والبروتوكول لإنشاء العدوى. قوالب الزجاج مفصل تمكين الإعداد مباشرة من القرنية لدراسات العدوى. نموذج يحاكي في العدوى الجسمية كما تكاثر البكتيريا يعتمد على قدرة البكتيريا على تلف أنسجة القرنية. يتم التحقق من إنشاء العدوى كزدّة في عدد وحدات تشكيل المستعمرة التي تم تقييمها عبر عد الصفائح القابلة للتطبيق. النتائج تثبت أنه يمكن أن تنشأ العدوى بطريقة استنساخها للغاية في القرنيات السابقين vivo باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. ويمكن توسيع النموذج في المستقبل لتقليد التهاب القرنية الناجم عن الكائنات الحية الدقيقة غير P. aeruginosa. الهدف النهائي من هذا النموذج هو التحقيق في تأثير العلاج الكيميائي المضاد للميكروبات على تقدم العدوى البكتيرية في سيناريو أكثر تمثيلاً في العدوى الجسمية. وبذلك، فإن النموذج الموصوف هنا سيقلل من استخدام الحيوانات للاختبار، ويحسن معدلات النجاح في التجارب السريرية، وفي نهاية المطاف سيمكن من الترجمة السريعة لمضادات الميكروبات الجديدة إلى العيادة.
Introduction
31 – تعد عدوى القرنية من الأسباب الهامة للعمى، وتحدث بنسب وبائية في البلدان المنخفضة الدخل والبلدان المتوسطة الدخل. وتختلف مسببات المرض من منطقة إلى أخرى ولكن البكتيريا تمثل أغلبية كبيرة من هذه الحالات. Pseudomonas aeruginosa هو الممرض المهم الذي يسبب مرض تقدمية بسرعة. في كثير من الحالات، ويترك المرضى مع تندب stromal، الاستجماتيزم غير النظامية، تتطلب زرع أو في أسوأ سيناريو، تفقد العين1،2.
التهاب القرنية البكتيرية الناجمة عن P. aeruginosa هو عدوى العين صعبة لعلاج خاصة بسبب الظهور المتزايد لسلالات مقاومة مضادات الميكروبات من P. aeruginosa. خلال العقد الماضي، أصبح من الواضح أن اختبار وتطوير علاجات جديدة لالتهابات القرنية، بشكل عام، وتلك التي تسببها Pseudomonas sp.، على وجه الخصوص، ضرورية لمكافحة الاتجاه الحالي في مقاومة المضادات الحيوية3.
لاختبار فعالية العلاجات الجديدة لالتهابات القرنية ، والأساليب التقليدية في المختبرات الميكروبيولوجية هي بديل الفقراء بسبب الفرق في علم وظائف الأعضاء البكتيرية خلال الثقافة المختبرية ، وخلال الالتهابات في الجسم الحي وكذلك بسبب عدم وجود واجهة المضيف4،5. في نماذج الحيوانات الحية، ومع ذلك، هي مكلفة، تستغرق وقتا طويلا، لا يمكن إلا أن تقديم عدد قليل من النسخ المتماثلة وإثارة المخاوف بشأن رعاية الحيوان.
في هذه المقالة، ونحن نبرهن على بسيطة وقابلة للاستنساخ organotypic السابقين vivo porcine نموذج من التهاب القرنية التي يمكن استخدامها لاختبار العلاجات المختلفة للعدوى الحادة والمزمنة. لقد استخدمنا P. aeruginosa لهذه التجربة ولكن النموذج يعمل أيضا بشكل جيد مع البكتيريا الأخرى، والكائنات الحية مثل الفطريات والخميرة التي تسبب التهاب القرنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
المحرك الرئيسي وراء تطوير هذا النموذج التهاب القرنية باستخدام القرنية السابقين vivo porcine هو تزويد الباحثين النامية مضادات الميكروبات الجديدة مع نموذج تمثيلي في المختبر لتحديد فعالية مضادات الميكروبات بدقة أكبر في المراحل قبل الظهر. وهذا سيوفر للباحثين المشاركين في تطوير مضادات الميكروبا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن أشكر إليوت Abattoir في تشيسترفيلد لتوفير عيون porcine. تم صنع الخواتم الزجاجية بناء على تصميمنا من قبل منفاخ الزجاج دان جاكسون من قسم الكيمياء في جامعة شيفيلد. ويود المؤلفون أن يشكروا مجلس البحوث الطبية (MR/S004688/1) على التمويل. كما يود أصحاب البلاغ أن يشكروا السيدة شانالي ديكويلا على مساعدتها التقنية في إعداد القرنية. الكتاب يود أن أشكر السيد جوناثان إيمري للمساعدة في تنسيق الصور.
Materials
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S. Keratitis. Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces. Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
