Summary
Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for å sette opp en ex vivo svin modell av bakteriell keratitt. Pseudomonas aeruginosa brukes som en prototypisk organisme. Denne innovative modellen etterligner in vivo infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av bakteriens evne til å skade hornhinnenvev.
Abstract
Ved utvikling av nye antimikrobielle legemidler er suksessen til dyreforsøk avhengig av nøyaktig ekstrapolering av antimikrobiell effekt fra in vitro-tester til dyreinfeksjoner in vivo. De eksisterende in vitro-testene overvurderer vanligvis antimikrobiell effekt da tilstedeværelsen av vertsvev som diffusjonsbarriere ikke er rede for. For å overvinne denne flaskehalsen har vi utviklet en ex vivo svin hornhinnemodell av bakteriell keratitt ved hjelp av Pseudomonas aeruginosa som en prototypisk organisme. Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av svinekorn og protokoll for etablering av infeksjonen. Skreddersydde glassformer muliggjør enkelt oppsett av hornhinnen for infeksjonsstudier. Modellen etterligner in vivo infeksjon som bakteriell spredning er avhengig av bakteriens evne til å skade hornhinnenvev. Etablering av infeksjon verifiseres som en økning i antall kolonidannende enheter vurdert via levedyktige platetall. Resultatene viser at infeksjon kan etableres på en svært reproduserbar måte i ex vivo hornhinnen ved hjelp av metoden som er beskrevet her. Modellen kan utvides i fremtiden for å etterligne keratitt forårsaket av andre mikroorganismer enn P. aeruginosa. Det endelige målet med modellen er å undersøke effekten av antimikrobiell kjemoterapi på fremdriften av bakteriell infeksjon i et scenario som er mer representativt for in vivoinfeksjoner. Dermed vil modellen som er beskrevet her redusere bruken av dyr for testing, forbedre suksessratene i kliniske studier og til slutt muliggjøre rask oversettelse av nye antimikrobielle til klinikken.
Introduction
Hornhinneinfeksjoner er viktige årsaker til blindhet og forekommer i epidemiske proporsjoner i lav- og mellominntektsland. Etiologien til sykdommen varierer fra region til region, men bakterier står for et stort flertall av disse tilfellene. Pseudomonas aeruginosa er et viktig patogen som forårsaker en raskt progressiv sykdom. I mange tilfeller er pasienter igjen med stromal arrdannelse, uregelmessig astigmatisme, krever transplantasjon eller i verste fall mister et øye1,2.
Bakteriell keratitt forårsaket av P. aeruginosa er en vanskelig øyeinfeksjon å behandle spesielt på grunn av den økende fremveksten av antimikrobielle resistente stammer av P. aeruginosa. I løpet av det siste tiåret har det blitt klart at testing og utvikling av nye behandlinger for hornhinneinfeksjoner generelt, og de som er forårsaket av Pseudomonas sp., spesielt, er avgjørende for å bekjempe den nåværende trenden i antibiotikaresistens3.
For å teste effekten av nye behandlinger for hornhinneinfeksjoner, er konvensjonelle in vitro mikrobiologiske metoder et dårlig surrogat på grunn av forskjellen i bakteriell fysiologi under laboratoriekultur og under infeksjoner in vivo, samt på grunn av mangel på vertsgrensesnittet4,5. In vivo dyremodeller er imidlertid dyre, tidkrevende, kan bare levere et lite antall repliker og reise bekymringer om dyrevelferd.
I denne artikkelen demonstrerer vi en enkel og reproduserbar organotypisk ex vivo svinemodell av keratitt som kan brukes til å teste ulike behandlinger for akutte og kroniske infeksjoner. Vi har brukt P. aeruginosa for dette eksperimentet, men modellen fungerer også bra med andre bakterier, og organismer som sopp og gjær som forårsaker keratitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Albino laboratoriekaniner ble ofret i laboratoriet for annet planlagt eksperimentelt arbeid under hjemmekontorgodkjente protokoller. Øynene var ikke nødvendig for eksperimentell bruk i disse studiene, så de ble brukt til denne protokollen.
1. Sterilisering
- KRITISK TRINN: Desinfiser alle tang og saks ved å bløtlegge i 1 time i 5% (v / v) oppløsning av Distel i destillert vann, rengjør med en børste, skyll med vann fra springen og steriliser i en ovn ved 185 ° C i minst 2 timer.
- Steriliser alle andre glass og reagenser ved autoklav ved 121 °C i 15 minutter eller klargjør reagenser i henhold til produsentens instruksjoner. Utfør følgende prosedyrer i et mikrobiologisikkerhetsskap i klasse II.
2. Eksempelsamling
- Samling av svineøyne
- Store hvite landrace purker, et kors med et Hampshire villsvin ble brukt. Dyrene ble lamslått med en elektrisk strøm og øynene ble 18 timer senere i slakteriet.
- KRITISK SKRITT: Når de er lysert, overfør øynene til laboratoriet i en steril fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) for å hindre dem i å tørke ut og behandle dem umiddelbart ved ankomst.
- Samling av kaninøyne
- Avgift hornhinnen og send til laboratoriet i steril PBS.
3. Utarbeidelse av hornhinnen knappen
- Bruk sterile tang for å holde vevet rundt øyebollet og overføre det til en petriskål. Fjern konjunktiva og muskelvev rundt øyeeplet på en petriskål ved hjelp av skalpellblad nr.
- Løft øyeeplet forsiktig mens du holder optisk nerve med tang og overfør til en 0,5 l krukke fylt med steril PBS.
- Når alle øyne er ryddet av omkringliggende vev, flytte dem ved hjelp av sterile tang til en annen 0,5 L krukke fylt med 3% (v / v) povidone jod i PBS og la stå i 1 min.
- Overfør øyeepler til en annen 0,5 l krukke med steril PBS.
- Bruk tang til å holde øyet fortsatt på en petriskål og lage et kutt i nærheten av hornhinnen med et skalpellblad nr 10A.
- KRITISK SKRITT: Hold kanten av kuttet og bruk saks for å avgiftsdirektoratet hornhinnen forlater ca 3 mm sclera rundt hornhinnen. Sørg for at den skarpe enden av saksen ikke pierce iris eller koroidalt vev og er i supra-choroidal plass.
- Hold hornhinnenskleralknapp med tang og bruk et annet par spisse endetrukker for å forsiktig skille uvealvevet.
- Løft hornhinnenskleralknapp fra gjenværende globus og skyll den kort i 1,5 % (v/v) povidon jodoppløsning i PBS i en 12-brønnplate.
- Plasser hornhinnen i en annen 12 brønnplate fylt med steril PBS.
- Etter behandling av alle øyne (anbefalt maksimalt 40 øyne i en batch),plasser hver hornhinneknapp til en individuell petriskål (34 mm diameter) epitelside opp og hell i 3 ml kulturmedium forvarmet til 37 °C.
MERK: Sammensetningen av kulturmediet er som følger: Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM): Hams [1:1] supplert med 5 μg∙ml-1 insulin og 10 ng∙ml-1 epidermal vekstfaktor (EGF), 10% (v / v) fosterkalsserum (FCS), 100 U∙ mL-1 penicillin, 100 U∙ml-1 streptomycin og 2,5 μg∙ml-1 amfotericin B. Som et valgfritt trinn kan mediet suppleres med 50 g∙L-1 dextran for å forhindre hevelse i den utskåret hornhinnen under de videre inkubasjonstrinnene. - Inkuber ved 37 °C i en fuktet vevskultur inkubator.
4. Vedlikehold av hornhinnen knappene
- Etter 24 timer, bruk aseptisk teknikk for å fjerne media og erstatte med 3 ml friske forvarmede kulturmedier som inneholder antibiotika. Hold hornhinnen knappene i media med antibiotika i 48 timer for å desinfisere hornhinnen. Inkuber ved 37 °C i en fuktet vevskultur inkubator.
- KRITISK SKRITT: Etter 48 timer fjerner du mediet og skyll hornhinnen med 2 ml PBS. Hold deretter hornhinnenskleralknapper i antibiotikafrie medier i minst to eller ideelt tre dager før eksperimentell infeksjon, for å fjerne gjenværende antibiotika fra vevet.
- Inkuber ved 37 °C i en fuktet vevskultur inkubator. Endre medier minst én gang til i løpet av disse tre dagene. Kast hornhinnen hvis noen turbiditet utvikler seg i antibiotikafritt medium.
5. Utarbeidelse av inoculum
- Hell 10 ml LB kjøttkraft i en konisk flaske på 50 ml med en skumpropp.
- Overfør en koloni av P. aeruginosa stamme PAO1 eller stamme PA14 fra en frisk agar plate og inkuber ved 37 ° C for 3-4 h til bakteriene er i midten av logfasen.
- Overfør bakteriekulturen til et 50 ml rør og sentrifuge ved 3000 x g i 5 min. Fjern supernatant og re-suspendere cellepellet i PBS.
- Gjenta trinn 5.3 to ganger til for å vaske cellene. Suspender cellepelleten på nytt i PBS og juster den optiske tettheten ved 600 nm til ca. 0,6 ved hjelp av steril PBS som blank.
6. Infisere hornhinnen knappen
- Fjern medier fra petriskålen og skyll hornhinnen to ganger med 1 ml steril PBS.
- Klem forsiktig tang mens du holder hornhinnen i mellom. Bruk en 10A skalpell for å gjøre fire kutt - to vertikale, to horisontale - i den sentrale delen av hornhinnen knappen gjennom epitellaget til den underliggende stroma.
- Legg en steril glassform i en 6-brønns plate med den brede delen opp og plasser hornhinnen midt i glassformen, epitelsiden vendt ned. Gjør kuttet rett i midten av den nederste delen av glassformen.
- KRITISK TRINN: Hell 1 ml 1% (w / v) lavt smeltepunkt agar oppløst i DMEM for å fylle glassformen med hornhinnen helt.
- La agaren sette og deretter invertere glassformen slik at hornhinnen epitelet vender oppover.
- Pipette 15 μL av bakteriekulturen med OD600nm = 0,6 (for P. aeruginosa tilsvarer dette ca. 1 x 107 kolonidanneenheter (CFU) i 15 μL) direkte i et kuttområde og legger deretter til 85 μL PBS til toppen for å holde hornhinnens epitel fuktig. Fortynn den gjenværende bakterielle kulturen og platen på agar for å telle kolonidannende enheter for inokulumet.
- Tilsett 1 ml DMEM uten antibiotika til bunnen av hver brønn med glassformen. Inkuber 6-brønnsplaten med de infiserte hornhinnenskleralknappene i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i opptil 24 timer.
- Sett opp uinfisert kontroll hornhinnen sammen med hvert eksperiment. For å sette opp uinfisert kontroll, erstatt 15 μL av bakteriell kultur i trinn 6.6 med steril PBS.
7. Homogenisering av hornhinnen for å høste bakteriene
- Kast DMEM-mediet fra bunnen av 6-brønnplaten og tilsett 1 ml steril PBS for å skylle bunnen av brønnen.
- Fjern PBS forsiktig ved å pipettere uten å berøre den sentrale delen av hornhinnenscleral-knappen. Fjern glassringen ved hjelp av sterile tang og plasser den i 5% Distel.
- Skyll forsiktig toppen av hornhinnenscleal-knapp med 1 ml PBS to ganger [valgfritt].
- Hold kanten av hornhinnen knappen med fine tips tang og løsne den fra agaren under.
- Overfør hornhinnen til et 50 ml rør fylt med iskald 1-2 ml PBS.
- Bruk en fin tips homogenisator for å ren toppen av den infiserte hornhinnen. Vevet trenger ikke å være helt likvidert. Homogenisatoren bidrar til å løsne bakterier fra hornhinnen epitel og kuttområdet.
- Vortex hornhinnen i PBS i noen sekunder for å blande innholdet.
- Tilsett 20 μL av homogenatet til 180 μL PBS og utfør seriefortynninger i en 96 brønnplate.
- Serialt fortynne suspensjonen til 10-4 og 10-5 fortynning og pipette 10 μL av fortynnet homogenat med bakterier på en blod agar plate. Inkuber platen i 8 timer og telle antall CFU. Ved testing av effekten av antimikrobielle legemidler må den aktuelle fortynningsfaktoren ankommes eksperimentelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utformingen av glassformene er en innovativ og original idé, hvis bruk tillot oss å sette opp modellen på en konsekvent måte med minimal / ingen problemer med forurensning. Formene ble utarbeidet av en glassblåser ved University of Sheffield basert på et design (Figur 1A). Det eksperimentelle oppsettet opprettholder den konvekse formen på hornhinnen og holder bakterier på toppen av epitelet der infeksjon finner sted (figur 1B).
Svin hornhinnene vanligvis hovne opp etter noen dager i medium. Dette er normalt, og vi fant at det ikke var noen signifikant forskjell mellom hornhinnen med og uten tilsetning av dextran, som vanligvis legges til for å forhindre hevelse i hornhinnen (figur 1H). Hornhinnene er vanligvis såret for å hjelpe bakteriene trenge inn i epitelet. Selv om det ikke var noen signifikant forskjell i utviklingen av infeksjon mellom sårede (kutt) og uavbrutt (uklippet) hornhinnen, la vi merke til flere variasjoner mellom repliker i uklippede hornhinnen (figur 1C). Vasking av hornhinnen to ganger med PBS fjerner overflødige bakterier som ikke festet seg til epitelet. Det var en betydelig forskjell i CFU mellom vasket og uvaskede svin hornhinner infisert med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer (Figur 1D). Det var ingen signifikant forskjell i CFU-tellinger mellom svin og kanin hornhinnen infisert med PA14 og PAO1 (figur 1E,1F). Resultatene for begge modellene var reproduserbare. Etter 24 timer utvikler hornhinnen infisert med enten Pseudomonas-stammen alltid opasitet og kuttområdet blir mer synlig og åpent i forhold til den uinfiserte hornhinnen (figur 1G).
Figur 1: Ex vivo hornhinnen infisert med Pseudomonas aeruginosa. (A)Skjematisk bilde av en glassform som brukes til å opprettholde formen på hornhinnen og legge til rette for innføring av bakterier og behandlinger. Tykkelsen på glassformene er 1, 5 mm og er den samme som tykkelsen på testrørene laget av borosilikatglass. (B)Skjematisk bilde av det eksperimentelle oppsettet. (C) Testing effekten av såret på den endelige CFU-tellingen etter homogenisering. Uncut (n = 16) og kutt (n = 28) hornhinner ble infisert med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer. Hornhinnene ble vasket med 1 ml PBS før homogenisering. Feilfelt indikerer standardavvik. (D) Teste effekten av å vaske hornhinner med 2 x 1 ml PBS (n = 6) og ikke vaske (n = 6) på den endelige CFU-tellingen etter infeksjon med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer. Feilfelt indikerer standardavvik. (E) Endelig CFU-telling i svinekorn infisert med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer (n = 10). Hornhinnen ble vasket og kuttet. Feilfelt indikerer standardavvik. (F)Endelig CFU-telling i kaninkorn infisert med P. aeruginosa PAO1 og P. aeruginosa PA14 i 24 timer (n = 6). Hornhinnen ble vasket og kuttet. Feilfelt indikerer standardavvik. (G)Bilder av ex vivo svin hornhinner infisert med P. aeruginosa PAO1 i 24 timer. Kontrollen ble såret, men ingen bakterier ble lagt til. De infiserte hornhinnene ble såret og 107 CFU ble lagt til kuttsiden. Ingen CFU ble gjenfunnet fra kontroll hornhinnen. (H) Endelig CFU gjenopprettet etter 24 timers infeksjon med P. aeruginosa PAO1 fra hornhinner behandlet med dekstran (n = 2) og de uten dekstran (n = 9). Hornhinnen ble vasket og kuttet. Feilfelt indikerer standardavvik. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den viktigste driveren bak utviklingen av denne keratitt modellen ved hjelp av ex vivo svin hornhinnen er å gi forskere utvikle nye antimikrobielle med en representativ in vitro modell for å mer nøyaktig bestemme antimikrobiell effekt på prekliniske stadier. Dette vil gi forskere som er involvert i å utvikle nye antimikrobielle legemidler større kontroll over legemiddeldesign og formulering på prekliniske stadier, øke suksessen i kliniske studier, redusere bruken av dyr ved å muliggjøre målrettede studier og resultere i raskere oversettelse av nye antimikrobielle til klinikken.
En rekke studier har undersøkt effekten av infeksjoner på ex vivo hornhinnen fra ulike dyr som: kanin6, hund7, geit8 oggriser 9,10,11. De fleste av disse studiene fokuserer på måter åetablere 6 og visualisere eninfeksjon 9, men så langt har det bare vært noen få publikasjoner med fokus på narkotikatesting og nøyaktig kvantifisering av bakterier6,7,8,12.
Den primære fordelen med vår modell er tilgjengeligheten av svinekornene som en del av næringskjeden. Bruken av ex vivo svin corneas er derfor i tråd med prinsippet om 3Rs, som er å erstatte, avgrense og redusere bruken av dyr i forskning, samtidig som det gir en representativ modell av vertsgrensesnittet. Vi har ikke observert noen problemer med forurensning av hornhinnen explants hvis protokollen følges strengt. Glassformene er veldig enkle, raske og enkle å bruke uten krav til spesialisert utstyr. Den smale ringen på toppen gjør tilsetning av en liten mengde av et testet stoff (100 μL) eller bakterier praktisk. Ringen av glassformen gjør at PBS med bakterier eller en legemiddelløsning kan beholdes i den sentrale delen av hornhinnen og hindrer bakteriene i å komme under hornhinnen. Ringen er lett å rengjøre og sterilisere, og tillater observasjon av endringene som oppstår på toppen av hornhinnen under infeksjon. Stammer av fluorescerende merkede bakterier kan brukes til å visualisere infeksjon eller kvantifisere spredningen av infeksjon i vevet ved hjelp av fluorescerende konfokal mikroskopi. Hele hornhinnen kan behandles videre for histologi eller elektronmikroskopiavbildning.
De kritiske trinnene er merket i protokollen. Ekstra oppmerksomhet må gis til disse trinnene når du utfører protokollen for å sikre vellykket infeksjon. De mest kritiske trinnene i protokollen er å sikre at hornhinnen behandles med tilstrekkelig antibiotika for å forhindre infeksjon under forberedelse, og deretter at antibiotika er tilstrekkelig eliminert før innføringen av den infeksiøs organismen, i dette tilfellet P. aeruginosa. Når du setter opp eksperimentene ved hjelp av denne protokollen, utviklet turbiditet i noen tilfeller turbiditet under inkubasjon i antibiotikafritt medium. Denne turbiditeten var et tegn på vekst av mikroorganismer i antibiotikafrie medier. Dette kan skyldes ufullstendig behandling av hornhinnen ved bruk av antibiotika eller på grunn av forurensning under håndtering. Disse hornhinnene ble ikke tatt frem for videre eksperimenter og ble kassert. Utvikling av turbiditet ved inkubering av hornhinnen i antibiotikafritt medium ble unngått ved å bruke hyppige steriliseringskjøringer i inkubatoren, ved hjelp av engangspipettespisser med et filter og ta tilstrekkelig forsiktighet når du steriliserer verktøyene som brukes til å utrydde hornhinnen fra svineøynene. Et annet kritisk skritt er når hornhinnene plasseres i glassformen før infeksjon. Glassformen gjør det mulig å opprettholde den konvekse formen på hornhinnen. Konveksiteten til hornhinnen er en utfordring for oppbevaring av enten infeksiøs dose eller terapeutisk middel på overflaten av hornhinnen. Derfor er det viktig å sikre tilstedeværelse av tilstrekkelig forsegling mellom hornhinnen og glassformen. Når det er tilstrekkelig forsegling mellom hornhinnen og glassformen, skaper ringstrukturen over formen et reservoar for å beholde enten den infeksiøs dosen eller terapeutiske middelet. En tilstrekkelig forsegling sikres ved å fylle den brede delen av glassformen helt med DMEM agar opp til randen.
Som tilfellet er med en hvilken som helst modell, er det begrensninger knyttet til ex vivo svin cornea modellen beskrevet. Modellen som er beskrevet her, etterligner ikke sammensetningen, flyten og etterfyllingen av tårefilmen over hornhinnen. Den mekaniske handlingen som tilbys ved blinkende er heller ikke innlemmet i modellen. Det er enighet i litteraturen om at rive film komposisjon og dynamikk, og blinkende er viktige forsvarsmekanismer som fjerner fremmede partikler og mikroorganismer fra øyet13. Faktisk mangler modellen også en immunrespons som utløses under infeksjon in vivo. Det er sannsynlig at utviklingen av infeksjon in vivo i nærvær av disse forsvarsmekanismene er forskjellig fra den som er observert i ex vivo-modellen som er beskrevet her. Til tross for disse begrensningene, ex vivo svin hornhinnen modellen er relevant for å teste effektiviteten av eksisterende og fremvoksende antimikrobielle midler for to hovedgrunner: 1) fysiologien til bakteriene i ex vivo modellen etterligner in vivo forhold som bakteriell spredning er avhengig av deres evne til å skade hornhinnen vev, og 2) modellen inkorporerer tredimensjonal vev som en diffusjon barriere for terapeutiske midler mye som i in vivo situasjon. Derfor er ex vivo-modellen en fordel over konvensjonelle teknikker for antimikrobiell følsomhetstesting.
Den ex vivo svin hornhinnen modellen beskrevet her kan også brukes til å studere ulike stammer av bakterier, sopp og gjær som forårsaker keratitt. Denne ex vivo hornhinnen modellen er reproduserbar og tillater en å generere replikere innen kort tid i motsetning til in vivo modeller. I stedet for PBS kan kunstige tårer eller vertsforsvarsceller teoretisk legges til for å etterligne live-scenariet. Hornhinnen er hentet fra samme type griser og ca 21-23 uker gammel når slaktet. Derfor er det mindre variasjon mellom replikere sammenlignet med de som er hentet fra menneskelige. Konseptet med å bruke en svin ex vivo hornhinnen modell for biomedisinske applikasjoner har fått mer popularitet i løpet av de siste årene på grunn av sin biologiske likhet med det menneskelige øye som gjør denne modellen lettere åsammenligne 14. Det er økt interesse for bruk av svinekorn fortransplantasjon 15,16 eller som modell for tørre øyne17 eller sårheling18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Elliot Abattoir i Chesterfield for å ha gitt svineøyne. Glassringene ble laget basert på vår design av glassblåseren Dan Jackson fra Department of Chemistry ved University of Sheffield. Forfatterne vil gjerne takke Medical Research Council (MR/S004688/1) for finansiering. Forfatterne vil også takke Fru Shanali Dikwella for teknisk hjelp med hornhinnen forberedelse. Forfatterne vil gjerne takke Mr Jonathan Emery for hjelp med formatering av bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Falcon tube | SLS | 352070 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Cellstar 12 well plate | Greiner Bio-One | 665180 | |
| Dextran | Sigma | 31425-100mg-F | |
| Distel | Fisher Scientific | 12899357 | |
| DMEM + glutamax | SLS | D0819 | |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal calf serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Handheld homogeniser 220 | Fisher Scientific | 15575809 | Homogeniser |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| LB agar | Sigma | L2897 | |
| Multitron | Infors | Not appplicable | Bacterial incubator |
| PBS | SLS | P4417 | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 12664785 | |
| Petri dish 35x10mm CytoOne | Starlab | CC7672-3340 | |
| Povidone iodine | Weldricks pharmacy | 2122828 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 |
References
- Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes. Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).
- Sharma, S.
- Sharma, G., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets. Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).
- Ersoy, S. C., et al. Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing. EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).
- Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure. EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).
- Pinnock, A., et al. Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).
- Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis. Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).
- Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis. Journal of Ophthalmic & Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).
- Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
- Brothers, K., et al. Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (7), (2015).
- Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
- Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C.
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Oh, J. Y., et al. Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications. Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).
- Shi, W. Y., et al. Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation. Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).
- Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye. Contact Lens & Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).
- Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
