Vi modellerer en enkel multiplekset ECL-analyse som kombinerer 7 autoantistoffanalyser sammen. Analysen er i stand til screening for T1D og flere andre autoimmune sykdommer, samtidig, inkludert cøliaki, autoimmun skjoldbrusk sykdom og autoimmunt polyglandulært syndrom 1.
Islet autoantistoffer (IAbs) er mye brukt i type 1 diabetes (T1D) diagnose og prediksjon. Fire store IAbs til insulin (IAA), glutamat dekarboksylase-65 (GADA), insulinom antigen-2 (IA-2A) og sinktransportør-8 (ZnT8A) er like viktige i sykdomsprediksjon. For tiden fortsetter opptil 40% av pasientene diagnostisert med T1D å utvikle andre autoimmune lidelser. Dessverre er dagens screeningmetoder ved bruk av et enkelt autoantistoff for måling arbeidskrevende og ineffektive for storskala screeningstudier. Vi har nylig utviklet en enkel multiplekset elektrokjemiluminescens (ECL) analyse for å løse disse aktuelle problemene. Analysen kombinerer alle 7 autoantistofftester i en brønn. Hver brønn inkluderer tre IAbs (IAA, GADA og IA-2A), autoantistoffer mot thyroid peroxidase (TPOA) og thyroid globulin (ThGA) for å oppdage autoimmun skjoldbrusk sykdom, autoantistoffer mot vevstransglutaminase (TGA) for cøliaki, og autoantistoffer mot interferon alfa (IFNαA) for autoimmunt polyglandulært syndrom-1 (APS-1); som alle skjermer for T1D og andre relevante autoimmune sykdommer, samtidig. Multiplex ECL-analysen er basert på plattformen for én ECL-analyse, men bruker i stedet multipleksplaten som kombinerer flere autoantistoffanalyser, opptil 10, i én enkelt brønn. Hovedforskjellen fra den enkle ECL-analysen er at hvert antistoff-antigenkompleks dannet i væskefasen holdes fast på et bestemt sted på hver brønn gjennom et linkersystem på multipleksplaten. 7-Plex ECL-analysen er i denne studien validert mot standard radiobindende analyser (RBA) og enkeltECL-analyser, ved bruk av en stor kohorte av nydiagnostiserte T1D-pasienter og alderstilpassede friske kontroller, noe som resulterer i utmerket analysefølsomhet og spesifisitet.
Type 1 diabetes (T1D) er en alvorlig kronisk sykdom som er mest vanlig i barndommen. For tiden har rundt 1.4 millioner mennesker T1D i USA; påfallende øker forekomsten av T1D jevnt med 3-5% hvert år over hele verden og har doblet seg de siste to tiårene, spesielt hos små barn 1,2. Islet autoantistoffer (IAbs) i blodsirkulasjonen er den mest pålitelige biomarkøren for tiden. IAbs kan vises år før klinisk T1D utvikler3. For tiden er fire store IAbs mye brukt i T1D-diagnose og risikoscreening, inkludert autoantistoffer mot insulin (IAA), glutamatdekarboksylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og sinktransportør-8 (ZnT8A). Disse fire IAbene er like viktige i prediksjon av T1D-utvikling. Klassifiseringen av T1D har nylig blitt omdefinert som tilstedeværelse av ≥2 av 4 IAbs med normal glukosemetabolisme som sykdomsstadium 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) ble det avslørt at ett av fire barn i fare for T1D sannsynligvis ville utvikle seg til øy, cøliaki, skjoldbruskkjertel eller revmatoid autoimmunitet, og mer påfallende utvikler omtrent 40% av pasientene som har blitt diagnostisert med T1D til slutt en ekstra autoimmun tilstand 5,6,7 . Identifisering av autoantistoffer er avgjørende for prediksjon og diagnose av disse autoimmune sykdommene og bør gi bedre klinisk behandling for pasienter. Det er ingen enkel og billig måte for tiden å skjerme for disse flere autoimmune tilstandene. Nåværende screeningmetoder ved bruk av standard radiobindingsanalyse (RBA), med en enkelt autoantistoffmåling, er arbeidskrevende og ineffektive for en storskala screening.
Her vil vi beskrive den nyutviklede enkle multipleksede ECL-analysen, som vi har autentisert ved hjelp av en enkelt ECL-analyseplattform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerer 7 autoantistofftester i en enkelt brønn, ved bruk av bare 15 μL serum, og er i stand til screening for T1D og flere relevante autoimmune sykdommer samtidig, inkludert cøliaki, autoimmun skjoldbrusk sykdom og APS-1. En ZnT8A ECL-analyse var ikke utviklet på det tidspunktet og var ikke inkludert i multiplekset analyse. Multiplex ECL-analysen gir et utmerket verktøy for høy gjennomstrømning i generell populasjonsscreening for T1D og flere autoimmune sykdommer.
I en rekke nasjonale og internasjonale kliniske studier for type 1 diabetes har ytelsen til den eneste ECL-analysen for å oppdage holmeautoantistoffer og autoantistoffer mot transglutaminase (TGA) for cøliaki, blitt underbygget 8,9,10,11. Gjennom disse sporene har denne analysen økt følsomheten og spesifisiteten for autoantigendeteksjon når den vurderes mot den eksisterende “gull” -standarden RBA. Den forbedrede sykdomsspesifisiteten kan ses ved diskriminering av autoantistoffer med høy affinitet og høyrisiko øyer fra signaler med lav risiko og lav affinitet, mellom den enkelte ECL-analysen og RBA 14,15,16,17. Basert på den enkle ECL-analysen utgjør vi en ny high throughput multiplekset ECL autoantistoffanalyse, slik at vi kan screene for T1D samt flere aktuelle autoimmune sykdommer samtidig.
Multiplex ECL-analysen bruker multipleksplaten, som kan kombinere opptil 10 autoantistoffanalyser i en enkelt brønn. For denne studien er 7 autoantistoffanalyser kombinert sammen. Autoantistoffene består av 3 IAbs (IAA, GADA og IA-2A), 2 autoimmune thyroid disease autoantistoffer (TPOA og ThGA), cøliaki autoantistoffer (TGA) og APS-1 autoantistoffer mot interferon alfa (IFNαA). Analysemekanismen er generelt basert på en enkelt ECL-analyse som tidligere publisert 9,10,12,18 med noen modifikasjoner. Hovedforskjellen i en multipleks ECL-analyse fra en enkelt ECL-analyse er at hvert antistoff-antigenkompleks dannet i væskefasen er begrenset til en spesifikk linker (figur 1). Biotinmerket antigen inkuberes med Streptavidin-konjugert, en linker som brukes til å danne et spesifikt antigenlinkerkompleks. Antistoff-antigen immunkompleks dannes etter inkubasjon med pasientserum og fanges på et bestemt sted gjennom det spesifikke linkersystemet på hver brønn i multiplexplaten. Ru Sulfo-NHS merket antigen fanget av antistoffer gir samtidig signalet med elektrokjemiluminescens. Platelesermaskinen kan oppdage opptil 10 forskjellige signaler fra spotkildene i hver brønn. For å holde autoantistoffanalyser konsistente mellom plater og mens du utfører langsiktige studier, foreslår vi at samme linker brukes.
Før du konfigurerer en multipleks-ECL-analyse, må enkle ECL-analyser for hvert autoantistoff optimaliseres på henholdsvis en multipleksplate og valideres mot både RBA- og enkeltECL-analyser på en vanlig ECL-plate. For å forbedre sjakkbrettanalysen, til den relaterte autoantistoffanalysen på multiplexplaten, ble det brukt en høy positiv pasient og en negativ pasientprøve. Etter at sjakkbrettanalysen ble utført, ble de mest ideelle konsentrasjonene for Ru Sulfo-NHS og biotin merket antigen beregnet for hver av de 7 autoantistoffanalysene. Følgende viser disse konsentrasjonene: 30 ng / ml og 200 ng / ml for GAD65, 120 ng / ml og 120 ng / ml for proinsulin, 10 ng / ml og 42 ng / ml for IA-2, 80 ng / ml og 80 ng / ml for TG, 8 ng / ml og 16 ng / ml for TPO, 31 ng / ml og 31 ng / ml for ThG, og henholdsvis 12 ng/ml og 12 ng/ml for IFNα13. Konsentrasjonene av noen av antigenene fra sjakkbrettanalysen må kanskje justeres ytterligere i henhold til resultatene i den faktiske multipleksanalysen etter å ha kombinert alle analysene sammen.
Siden IAA er inkludert i den foreliggende multipleks-ECL-analysen, er syrebehandling av serumprøver obligatorisk før seruminkubering med antigen, som rapportert i forrige studie12. Vanligvis, når et ekstra autoantistoff legges til en multipleksanalyse, påvirkes analysebakgrunnen, og et ekstremt høyt signal fra ett sted, i brønnen, kan hindre resultatene av nærliggende flekker via crosstalk. Derfor må maksimal CPS begrenses til 20 000 tellinger for hvert autoantistoff, eller lavere, for de høyeste positive prøvene. Fra vår kunnskap, for å redusere mengden crosstalk involvert, bør autoantistoffer som har lavere bakgrunn skilles når du designer spotkartet, langt fra flekker med høyere frekvens av teller.
Høye positive og negative kontroller ble brukt internt i hver analyse for å beregne en nøyaktig indeks for de ukjente prøvene som ble testet. For å nøyaktig vurdere og overvåke analysens følsomhet ble det brukt lave positive kontroller, satt nær analysens øvre grense. Disse standard positive og negative kontrollene ble opprettet i bulk og aliquot for langvarig bruk og lagret ved -20 ° C eller under, for konsistens mellom analyser. For kvalitetssikringsformål ble prøvene kjørt to ganger i hver analyse, og hvert positive resultat ble reran og bekreftet ved å kjøre prøven i en ny ECL-analyse neste dag. Hvis det var uenighet med den første og andre bekreftende analysen, var en tredje analyse nødvendig. Av de tre analysene som ble utført, bestemte resultatene av de to analysene som er enige (f.eks. +, + eller -,-), det endelige resultatet (positivt eller negativt) av prøven.
I løpet av det siste tiåret søker mange studiegrupper en høy gjennomstrømningsanalyse ved å bruke multiplex-metoden for å kombinere flere autoantistoffanalyser sammen i en brønn for å skjerme store populasjoner. Det er noen få studier som bruker forskjellige typer teknologier for å utføre multiplex autoantistoffanalyser 19,20,21,22, men det er ingen sammenligning for noen av disse analysene i følsomhet og spesifisitet mot den nåværende ‘gull’ standarden RBA, når man studerer T1D. Disse forskjellige typer plattformer som brukes, valideres ikke gjennom det internasjonale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) verkstedet eller gjennom testing av store kohorter i kliniske studier. I en nylig generell populasjonsbasert screening i Tyskland blir en kombinert analyse med høy gjennomstrømning, 3 Screen ICATM ELISA distribuert av Kronus, brukt som et verktøy for førstelinjescreening for å oppdage tre IAbs, GADA, IA-2A og ZnT8A, for å oppnå tidlig diagnose av barndommen T1D23. 3-Screen ELISA-analysen måler 3 autoantistoffer enten i 3 separerte brønner, forbruker et stort volum serum, eller i en enkelt brønn med alle 3 analysene blandet. Hvis en brønn i 3-Screen ELISA-analysen er positiv, er man ikke i stand til å skille hvilken av tre autoantistoffer som er tilstede. Den største ulempen med denne analysen er dens manglende evne til å inkludere IAA-måling. Alle IAA-resultater utført av ELISA, som bevist i IASP-workshops, har ikke en akseptabel følsomhet og spesifisitet24. IAA er vanligvis den første IAb som vises og har en høy prevalens blant små barn. IAb-screening, med IAA, er nødvendig for barn, og det anses ikke akseptabelt å gjennomføre denne screeningen uten IAA for å vurdere T1D-risiko i samfunnet. I tillegg er det ingen publiserte studier eller data som viser at Kronus IAb-settanalysen er mer T1D-sykdomsspesifikk og i stand til å diskriminere høy risiko fra lavrisiko IAbs. 7-Plex ECL-analysen ble i denne studien validert ved hjelp av en stor kohort av nydiagnostiserte pasienter med T1D13. Sammenlignet med dagens standard RBA og veletablerte enkelt ECL-analyse, er 7-Plex-analysen i stand til å beholde 100% positivitet med samme analysespesifisitet (tabell 4). For tiden blir 4-Plex ECL-analysen, parallelt med standard RBA, brukt på en pågående stor klinisk studie: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) studie. Denne rettssaken skjermer barn i befolkningen generelt, i Denver storbyområdet, for T1D og cøliaki. Sammenlignet med standard RBA brukt i ASK-studien, viser multipleks-ECL-analysen utmerket sensitivitet og høyere sykdomsspesifisitet, identisk med våre tidligere rapporter ved bruk av enkelt ECL-studie25. Videre viste vår 4-plex ECL-analyse en uttalt reduksjon i arbeidskraft, kostnader og serumvolum med 70%, sammenlignet med de tilsvarende 4 enkeltanalysene for ECL og RBA. Ved hjelp av den multipleksede ECL-analysen kan vi tilpasse hver brønn med forskjellige tall, som representerer forskjellige autoantistoffer (opptil 10), for å teste for forskjellige autoimmune sykdommer som er spesifikke for behovene til et bestemt klinisk sted.
Det er observert noen begrensninger, vist i denne studien, for en multiplekset ECL-analyse ved bruk av multipleksplaten. Den endelige fortynningen av serum, inkubert med antigen, kan ikke justeres for å gi de mest optimale forholdene for hver enkelt autoantistoffanalyse som kombineres i en enkelt brønn. Ni prøver (9/1026), fra T1D-pasienter, ble observert å ha et falskt negativt resultat for bestemte autoantistoffer. 7 av de falske negativene var for TPOA og 2 var for ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men høye positive resultater ble vist i både enkelt ECL-analyse og RBA (figur 2 & 3). Etter ytterligere fortynning av alle 9 prøvene ble de positive på multiplexplaten. Dette resultatet er forårsaket av, hva vi beskriver som “prozone” fenomenet. Dette fenomenet fører til at prøven viser et falskt negativt resultat fordi de høye antistofftiterne påvirker dannelsen av antigenantistoffgitter. Ved oppsett av en multipleksanalyse anbefales det at prøver med svært høye titere for hvert av de kombinerte autoantistoffene kjøres forhåndstester for å identifisere valgfri fortynning av serum for antigeninkubasjon. Alternativt bør autoantistoffanalyser med lignende optimaliserte forhold velges for å danne en kombinert analyse hvorfra den beste analysefølsomheten og spesifisiteten oppnås for hvert autoantistoff. I denne studien resulterte 7 prøver (7/1022), fra friske normale kontroller, i falske positiver for flere autoantistoffer i 7-Plex-analysen, men etter å ha kjørt en enkelt ECL-analyse og RBA (figur 2 & 3) ble disse autoantistoffene funnet å være negative i begge analysene. Årsakene bak disse falske positive resultatene som forekommer på multiplexplaten, for disse små delmengdene av prøver, er foreløpig ukjente. For den nåværende anvendelsen av multipleks-ECL-analysen gjentas alle positive prøver med den tilsvarende enkelt-ECL-analysen for å bekrefte positivitet, noe som fjerner denne falske positive feilen fra multipleks-ECL-analysen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R og 2-SRA-2018-533-S-B.
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac – Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |