Vi modellerar en enkel multiplexerad ECL-analys som kombinerar 7 autoantikroppsanalyser tillsammans. Analysen kan screena för T1D och flera andra autoimmuna sjukdomar samtidigt, inklusive celiaki, autoimmun sköldkörtelsjukdom och autoimmunt polyglandulärt syndrom 1.
Ö-autoantikroppar (IAbs) används ofta vid diagnos och förutsägelse av typ 1-diabetes (T1D). Fyra stora IAb till insulin (IAA), glutamatdekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransportör-8 (ZnT8A) är lika viktiga för sjukdomsförutsägelse. För närvarande fortsätter upp till 40% av patienterna som diagnostiserats med T1D att utveckla andra autoimmuna störningar. Tyvärr är nuvarande screeningmetoder som använder en enda autoantikropp för mätning mödosamma och ineffektiva för storskaliga screeningstudier. Vi utvecklade nyligen en enkel multiplexerad elektrokemiluminescensanalys (ECL) för att ta itu med dessa aktuella problem. Analysen kombinerar alla 7 autoantikroppstester i en brunn. Varje brunn innehåller tre IAbs (IAA, GADA och IA-2A), autoantikroppar mot sköldkörtelperoxidas (TPOA) och sköldkörtelglobulin (ThGA) för att upptäcka autoimmun sköldkörtelsjukdom, autoantikroppar mot vävnadstransglutaminas (TGA) för celiaki och autoantikroppar mot interferon alfa (IFNαA) för autoimmunt polyglandulärt syndrom-1 (APS-1); som alla screenar för T1D och andra relevanta autoimmuna sjukdomar, samtidigt. Multiplex ECL-analysen är baserad på den enda ECL-analysplattformen, men använder istället multiplexplattan som kombinerar flera autoantikroppsanalyser, upp till 10, i en enda brunn. Huvudskillnaden från den enda ECL-analysen är att varje antikroppsantigenkomplex som bildas i vätskefasen är fasthållet på en specifik plats på varje brunn genom ett länksystem på multiplexplattan. 7-Plex ECL-analysen, i den aktuella studien, valideras mot standard radiobindande analyser (RBA) och enstaka ECL-analyser, med hjälp av en stor kohort av nydiagnostiserade T1D-patienter och åldersmatchade friska kontroller, vilket resulterar i utmärkt analyskänslighet och specificitet.
Typ 1-diabetes (T1D) är en allvarlig kronisk sjukdom som är vanligast vid barndomen. För närvarande har cirka 1.4 miljoner människor T1D i USA; Slående är att förekomsten av T1D stadigt ökar med 3-5% varje år över hela världen och har fördubblats under de senaste två decennierna, särskilt hos små barn 1,2. Islet autoantikroppar (IAbs) i blodcirkulationen är den mest tillförlitliga biomarkören för närvarande. IAbs kan förekomma år innan klinisk T1D utvecklar3. För närvarande används fyra stora IAbs i stor utsträckning vid T1D-diagnos och riskscreening inklusive autoantikroppar mot insulin (IAA), glutamatdekarboxylas-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) och zinktransportör-8 (ZnT8A). Dessa fyra IAbs är lika viktiga för att förutsäga T1D-utveckling. Klassificeringen av T1D har nyligen omdefinierats som förekomsten av ≥2 av alla 4 IAb med normal glukosmetabolism som sjukdomsstadium 14.
I Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) avslöjades att ett av fyra barn i riskzonen för T1D sannolikt skulle utvecklas till ö-, celiaki-, sköldkörtel- eller reumatoid autoimmunitet och mer slående, cirka 40% av patienterna som har diagnostiserats med T1D utvecklar så småningom ett ytterligare autoimmunt tillstånd 5,6,7 . Identifiering av autoantikroppar är avgörande för förutsägelse och diagnos av dessa autoimmuna sjukdomar och bör ge bättre klinisk vård för patienter. Det finns för närvarande inget enkelt och billigt sätt att screena för dessa flera autoimmuna tillstånd. Nuvarande screeningmetoder med hjälp av standard radiobindande analys (RBA), med en enda autoantikroppsmätning, är mödosamma och ineffektiva för en storskalig screening.
Här kommer vi att beskriva den nyutvecklade enkla multiplexerade ECL-analysen, som vi har autentiserat med en enda ECL-analysplattform 8,9,10,11. Multiplex ECL-analysen kombinerar 7 autoantikroppstester i en enda brunn, med endast 15 μL serum, och kan screena för T1D och flera relevanta autoimmuna sjukdomar samtidigt inklusive celiaki, autoimmun sköldkörtelsjukdom och APS-1. En ZnT8A ECL-analys hade inte utvecklats vid den tiden och ingick inte i den multiplexerade analysen. Multiplex ECL-analysen ger ett utmärkt verktyg för hög genomströmning i allmän befolkningsscreening för T1D och flera autoimmuna sjukdomar.
I många nationella och internationella kliniska prövningar för typ 1-diabetes har prestandan hos den enda ECL-analysen för att upptäcka ö-autoantikroppar och autoantikroppar mot transglutaminas (TGA) för celiakistyrkts 8,9,10,11. Under dessa spår har denna analys ökat känsligheten och specificiteten för autoantigendetektering när den bedöms mot den befintliga “guld” -standarden RBA. Den förbättrade sjukdomsspecificiteten kan ses när man diskriminerar autoantikroppar med hög affinitet och hög risk från lågrisksignaler med låg affinitets, mellan den enda ECL-analysen och RBA14,15,16,17. Baserat på den enda ECL-analysen utgör vi en ny multiplexerad ECL-autoantikroppsanalys med hög genomströmning för att göra det möjligt för oss att screena för T1D samt flera tillämpliga autoimmuna sjukdomar samtidigt.
Multiplex ECL-analysen använder multiplexplattan, som kan kombinera upp till 10 autoantikroppsanalyser i en enda brunn. För den aktuella studien kombineras 7 autoantikroppsanalyser tillsammans. Autoantikropparna består av 3 IAbs (IAA, GADA och IA-2A), 2 autoimmuna autoantikroppar mot sköldkörtelsjukdom (TPOA och ThGA), autoantikroppar mot celiaki (TGA) och APS-1 autoantikroppar mot interferon alfa (IFNαA). Analysmekanismen är i allmänhet baserad på en enda ECL-analys som tidigare publicerats 9,10,12,18 med vissa modifieringar. Huvudskillnaden för en multiplex ECL-analys från en enda ECL-analys är att varje antikroppsantigenkomplex som bildas i vätskefasen är fasthållet till en specifik länkare (figur 1). Det biotinmärkta antigenet inkuberas med Streptavidin-konjugerat, en länkare som används för att bilda ett specifikt antigen-linker-komplex. Antikroppsantigenimmunkomplex bildas efter inkubation med patientserum och fångas upp på en specifik plats genom det specifika länksystemet på varje brunn i multiplexplattan. Ru Sulfo-NHS-märkt antigen fångat av antikroppar samtidigt ger signalen elektrokemiluminescens. Plattläsarmaskinen kan detektera upp till 10 olika signaler från punktkällorna i varje brunn. För att hålla autoantikroppsanalyser konsekventa mellan plattorna och vid långtidsstudier föreslår vi att samma länkare används.
Innan du ställer in en multiplex ECL-analys måste enstaka ECL-analyser för varje autoantikropp optimeras på en multiplexplatta respektive valideras mot både RBA- och enstaka ECL-analyser på en vanlig ECL-platta. För att förbättra schackbrädesanalysen, till den relaterade autoantikroppsanalysen på multiplexplattan, användes en högpositiv patient och ett negativt patientprov. Efter att schackbrädets analys genomfördes beräknades de mest idealiska koncentrationerna för Ru Sulfo-NHS och biotinmärkt antigen för var och en av de 7 autoantikroppsanalyserna. Följande visar dessa koncentrationer: 30 ng/ml och 200 ng/ml för GAD65, 120 ng/ml och 120 ng/ml för proinsulin, 10 ng/ml och 42 ng/ml för IA-2, 80 ng/ml och 80 ng/ml för TG, 8 ng/ml och 16 ng/ml för TPO, 31 ng/ml och 31 ng/ml för ThG, och 12 ng/ml respektive 12 ng/ml för IFNα13. Koncentrationerna av vissa av antigenerna från kontrollplansanalysen kan behöva justeras ytterligare beroende på resultaten i den faktiska multiplexanalysen efter att alla analyser har kombinerats tillsammans.
Eftersom IAA ingår i den nuvarande multiplexa ECL-analysen är syrabehandling av serumprover obligatorisk innan serumet inkuberas med antigen, vilket rapporterades i den tidigare studien12. I allmänhet, när en extra autoantikropp läggs till i en multiplexanalys, påverkas analysbakgrunden och en extremt hög signal från en plats, i brunnen, kan hindra resultaten av närliggande fläckar via överhörning. Därför måste den maximala CPS begränsas till 20 000 räkningar för varje autoantikropp, eller lägre, för de högsta positiva proverna. Från vår kunskap, för att minska mängden överhörning som är inblandad, bör autoantikroppar som har en lägre bakgrund separeras, när man utformar spotkartan, långt ifrån fläckar med högre frekvens av räkningar.
Höga positiva och negativa kontroller användes internt i varje analys för att beräkna ett exakt index för de okända prover som testades. För att noggrant bedöma och övervaka analysens känslighet användes låga positiva kontroller, inställda nära analysens övre gräns. Dessa positiva och negativa standardkontroller skapades i bulk och alikvot för långvarig användning och lagrades vid -20 °C eller lägre, för överensstämmelse mellan analyserna. För kvalitetssäkringsändamål kördes prover två gånger i varje analys och varje positivt resultat reran och bekräftades genom att köra provet i en ny ECL-analys nästa dag. Om det fanns någon oenighet med den första och andra bekräftande analysen var en tredje analys nödvändig. Av de tre genomförda analyserna bestämde resultaten av de två analyserna som överensstämmer (t.ex. +, + eller -,-) det slutliga resultatet (positivt eller negativt) av provet.
Under det senaste decenniet söker många studiegrupper en analys med hög genomströmning med hjälp av multiplexmetoden för att kombinera flera autoantikroppsanalyser tillsammans till en brunn för att screena stora populationer. Det finns några studier som använder olika typer av tekniker för att genomföra multiplex autoantikroppsanalyser 19,20,21,22, men det finns ingen jämförelse för någon av dessa analyser i känslighet och specificitet mot den nuvarande “guld” -standarden RBA, när man studerar T1D. Dessa olika typer av plattformar som används valideras inte genom den internationella IASP-workshopen (Islet Autoantibody Standardization Program) eller genom att testa stora kohorter i kliniska prövningar. I en nyligen genomförd allmän befolkningsbaserad screening i Tyskland används en kombinerad analys med hög genomströmning, 3 Screen ICATM ELISA distribuerad av Kronus, som ett verktyg för första linjens screening för att upptäcka tre IAbs, GADA, IA-2A och ZnT8A, för att uppnå tidig diagnos av barndomens T1D23. 3-Screen ELISA-analysen mäter 3 autoantikroppar antingen i 3 separerade brunnar, konsumerar en stor volym serum eller i en enda brunn med alla 3 analyser blandade. Om en brunn i 3-Screen ELISA-analysen är positiv kan man inte skilja vilken av tre autoantikroppar som finns. Den största nackdelen med denna analys är dess oförmåga att inkludera IAA-mätning. Alla IAA-resultat som utförs av ELISA, vilket bevisats i IASP-workshops, har inte en acceptabel känslighet och specificitet24. IAA är vanligtvis den första IAb som visas och har en hög prevalens bland små barn. IAb-screening, med IAA, är nödvändig för barn och det anses inte acceptabelt att genomföra denna screening utan IAA för att bedöma T1D-risken i samhället. Dessutom finns det inga publicerade studier eller data som visar att Kronus IAb-kitanalysen är mer T1D-sjukdomsspecifik och kan skilja hög risk från lågrisk-IAbs. 7-Plex ECL-analysen, i den aktuella studien, validerades med hjälp av en stor kohort av nydiagnostiserade patienter med T1D13. Jämfört med den nuvarande standard RBA och väletablerade enda ECL-analys kan 7-Plex-analysen behålla 100% positivitet med samma analysspecificitet (tabell 4). För närvarande tillämpas 4-Plex ECL-analysen, parallellt med standard RBA, på en pågående stor klinisk prövning: Autoimmunity Screening for Kids (ASK) -studie. Denna studie visar barn i den allmänna befolkningen, i Denver storstadsområde, för T1D och celiaki. Jämfört med standard RBA som används i ASK-studien visar multiplex ECL-analysen utmärkt känslighet och en högre sjukdomsspecificitet, identisk med våra tidigare rapporter med den enda ECL-studien25. Dessutom visade vår 4-Plex ECL-analys en uttalad minskning av arbets-, kostnads- och serumvolymen med 70%, jämfört med motsvarande 4 enskilda analyser för ECL och RBA. Med hjälp av den multiplexerade ECL-analysen kan vi anpassa varje brunn med olika siffror, som representerar olika autoantikroppar (upp till 10), för att testa för olika autoimmuna sjukdomar som är specifika för behoven på en viss klinisk plats.
Det finns vissa begränsningar observerade, som visas i den aktuella studien, för en multiplexerad ECL-analys med multiplexplattan. Den slutliga utspädningen av serum, inkuberad med antigen, kan inte justeras för att ge de mest optimala förhållandena för varje enskild autoantikroppsanalys som kombineras i en enda brunn. Nio prover (9/1026), från T1D-patienter, observerades ha ett falskt negativt resultat för vissa autoantikroppar. 7 av de falska negativa var för TPOA och 2 var för ThGA, i 7-Plex ECL-analysen, men höga positiva resultat uppvisades i både den enda ECL-analysen och RBA (figur 2 & 3). Efter ytterligare utspädning av alla 9 prover blev de positiva på multiplexplattan. Detta resultat orsakas av, vad vi beskriver som “prozon” -fenomenet. Detta fenomen gör att provet visar ett falskt negativt resultat eftersom de höga antikroppstitrarna påverkar bildandet av antigen-antikroppsgitter. Vid upprättandet av en multiplexanalys rekommenderas prover med mycket höga titrar, för var och en av de kombinerade autoantikropparna, att låta förtester köras för att identifiera den valfria utspädningen av serum för antigeninkubation. Alternativt bör autoantikroppsanalyser med liknande optimerade förhållanden väljas för att bilda en kombinerad analys från vilken den bästa analyskänsligheten och specificiteten uppnås för varje autoantikropp. I den aktuella studien resulterade 7 prover (7/1022), från friska normala kontroller, i falska positiva resultat för flera autoantikroppar i 7-Plex-analysen, men efter att ha kört en enda ECL-analys och RBA (figur 2 & 3) befanns dessa autoantikroppar vara negativa i båda analyserna. Orsakerna bakom dessa falskt positiva resultat som förekommer på multiplexplattan, för dessa små delmängder av prover, är för närvarande okända. För den nuvarande tillämpningen av multiplex ECL-analysen upprepas alla positiva prover med motsvarande enda ECL-analys för att bekräfta positivitet, vilket tar bort detta falska positiva fel från multiplex ECL-analysen.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag DK32083, JDRF-bidrag 2-SRA-2015-51-Q-R och 2-SRA-2018-533-S-B.
4 °C refrigerator | |||
–80 °C and -20 °C freezers | |||
96-well Plate Shaker | Wallac – Delfi | ||
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Acetic acid solution | Fisher | ||
Aluminum foil | |||
Antigen proteins | |||
Human GAD65 full length protein | Diamyd | ||
Human ThG full length protein | BioMart | ||
Human TPO full length protein | BioMart | ||
IA-2 intracellular domain protein | BioMart | ||
IFN-α protein | Abcam | ||
Proinsulin protein | AmideBio | ||
tTG protein | DiaRect | ||
Biotin | Sigma | ||
Bottle-Top 500 mL , Filter Units | Fisher | 0974064A or B | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
Distilled deionized (DD) water | |||
HCl | Fisher | ||
Ice maker | |||
Ice trays | |||
MSD Sector | Perkin-Elmer | ||
Multi-channel pipette | |||
NaOH | |||
Paper tower | |||
PBS | |||
pH meter | |||
Pipette-Aid | |||
Pipettes/tips | |||
Ru Sulfo-NHS | MSD (R91AN) | ||
Trizma Base | Fisher | BP152-5 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
Uplex Development Kit | MSD | ||
96-well UPlex plate | MSD | ||
Blocker A | MSD | R93AA | |
Linker-Streptavidin | MSD | ||
Read buffer | MSD | R92TC | |
Stop Solution | MSD | ||
Vortex mixer | |||
ZeBa Column | Pierce | 89892 |