Estudando efeitos da fumaça do cigarro na infecção por pseudomonas em células epiteliais pulmonares
Summary
Descrito aqui é um protocolo para estudar como o extrato de fumaça de cigarro afeta a colonização bacteriana em células epiteliais pulmonares.
Abstract
O tabagismo é a principal causa etiológica para enfisema pulmonar e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). O tabagismo também promove a suscetibilidade a infecções bacterianas no sistema respiratório. No entanto, os efeitos do tabagismo em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares humanas ainda não foram estudados minuciosamente. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a preparação de extratos de tabagismo de cigarro (ECA), tratamento de células epiteliais pulmonares humanas com ESC, e determinação de infecção bacteriana e infecção. O CSE foi preparado com um método convencional. As células epiteliais pulmonares foram tratadas com 4% de CSE para 3 h. As células tratadas com CSE foram, então, infectadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As cargas bacterianas das células foram determinadas por três métodos diferentes. Os resultados mostraram que a CSE aumentou a carga de Pseudomonas em células epiteliais pulmonares. Este protocolo, portanto, fornece uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.
Introduction
O tabagismo afeta a saúde pública de milhões de pessoas em todo o mundo. Muitas doenças deletérios, incluindo câncer de pulmão e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), estão relacionadas ao tabagismo1,,2. O tabagismo aumenta a suscetibilidade a infecções microbianas agudas no sistema respiratório3,,4,5. Além disso, evidências crescentes comprovam que o tabagismo aumenta a patogênese de muitas doenças crônicas6,,7,8. Por exemplo, o tabagismo pode aumentar as infecções virais ou bacterianas que causam a exacerbação da DPOC9. Entre os patógenos bacterianos que contribuem etiologicamente para a exacerbação aguda da DPOC, um patógeno de bacilo gram-negativo oportunista, Pseudomonas aeruginosa,causa infecções que se correlacionam com prognósticos ruins e maiores mortalidades10,11. A exacerbação da DPOC piora a doença acelerando a progressão patológica. Não há terapias eficazes contra a exacerbação da DPOC, exceto para a gestão antissintomática12. A exacerbação da DPOC promove a mortalidade do paciente, diminui a qualidade de vida e aumenta a carga econômica sobre a sociedade13.
As vias respiratórias são um sistema aberto, continuamente submetido a vários patógenos microbianos presentes externamente. Patógenos bacterianos oportunistas são geralmente detectados nas vias aéreas superiores, mas às vezes são observados nas vias aéreas inferiores14,15. Nos modelos animais P. aeruginosa pode ser detectado em sacos alveolares logo 1h após a infecção16. Como um grande mecanismo de defesa, células imunes como macrófagos ou neutrófilos eliminam as bactérias nas vias aéreas. As células epiteliais pulmonares, como a primeira barreira fisiológica, desempenham um papel único na defesa do hospedeiro contra infecções microbianas. As células epiteliais pulmonares podem regular a invasão microbiana, colonização ou replicação independente das células imunes17. Algumas moléculas encontradas em células epiteliais, incluindo PPARg, exercem funções antibacterianas, regulando assim a colonização bacteriana e a replicação nas células epiteliais pulmonares18. O tabagismo pode alterar as moléculas e prejudicar a função normal de defesa nas células epiteliais pulmonares19,20. Estudos recentes relataram exposição direta da fumaça do cigarro às células epiteliais pulmonares usando o aparelho de fumo robô21,22. A exposição à fumaça pode ser realizada de outras formas, incluindo a aplicação de CSE. A preparação do CSE é uma abordagem reprodutível com aplicações potenciais em outros tipos de células, incluindo células endoteliais vasculares que são indiretamente expostas à fumaça de cigarro.
Este relatório descreve um protocolo para gerar extrato de fumaça de cigarro para alterar a carga bacteriana em células epiteliais pulmonares. O CSE aumenta a carga bacteriana de P. aeruginosa,e pode contribuir para a recidiva de infecções bacterianas geralmente vistas na exacerbação da DPOC. Um método convencional é usado para a preparação de CSE. As células epiteliais pulmonares, em seu estágio de crescimento exponencial, são tratadas com 4% de ESC por 3 h. Alternativamente, as células epiteliais pulmonares cultivadas por monocamadas podem ser diretamente expostas à fumaça do cigarro em uma interface ar-líquido. As células tratadas com CSE são então desafiadas com Pseudomonas em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. As bactérias são propagadas a uma velocidade de agitação particular para garantir que a morfologia de sua flagela permaneça intacta para manter sua capacidade invasiva total. A gentamicina é empregada para matar as bactérias deixadas no meio da cultura, reduzindo assim a contaminação potencial durante a subsequente determinação da carga bacteriana. O protocolo também usa Pseudomonascom a etiqueta GFP, que tem sido utilizada como uma poderosa ferramenta para estudar a infecção por Pseudomonas em diferentes modelos. Uma cepa representativa é P. fluorescens Migula23. O grau de infecção ou carga bacteriana após o tratamento de ESE é determinado de três maneiras: o método de placa de gota com contagem de colônias, PCR quantitativo usando primers pseudomonas 16S rRNA ou citometria de fluxo em células infectadas com Pseudomonasfluorescentes . Este protocolo é uma abordagem simples e reprodutível para estudar o efeito da fumaça de cigarro em infecções bacterianas em células epiteliais pulmonares.
Protocol
Representative Results
Discussion
A invasão bacteriana em células epiteliais pulmonares é um passo crucial na patogênese das infecções bacterianas. O processo de invasão bacteriana nas células pode ser dividido nas seguintes três etapas: Primeiro, as bactérias entram em contato e aderem à superfície da célula epitelial usando sua flagela. Em segundo lugar, as bactérias são submetidas à internalização ou penetram na membrana celular. Finalmente, as bactérias se replicam e colonizam as células se escapam com sucesso dos mecanismos de de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por um Instituto Nacional de Saúde R01 concede HL125435 e HL142997 (para CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
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