Studere effekter av sigarettrøyk på Pseudomonas infeksjon i lunge epitelceller
Summary
Beskrevet her er en protokoll for å studere hvordan sigarettrøyk ekstrakt påvirker bakteriell kolonisering i lunge epitelceller.
Abstract
Sigarettrøyking er den viktigste etiologiske årsaken til lungeembosem og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Sigarettrøyking fremmer også følsomhet for bakterielle infeksjoner i luftveiene. Effekten av sigarettrøyking på bakterielle infeksjoner i humane lungeepitelceller er imidlertid ennå ikke grundig undersøkt. Beskrevet her er en detaljert protokoll for fremstilling av sigarettrøykeekstrakter (CSE), behandling av humane lungeepitelceller med CSE, og bakteriell infeksjon og infeksjonsbestemmelse. CSE ble utarbeidet med en konvensjonell metode. Lungeepitelceller ble behandlet med 4 % CSE i 3 timer CSE-behandlede celler var da infisert med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakterielle belastninger av cellene ble bestemt av tre forskjellige metoder. Resultatene viste at CSE økte Pseudomonas belastning i lunge epitelceller. Denne protokollen gir derfor en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.
Introduction
Sigarettrøyking påvirker den offentlige helsen til millioner av mennesker over hele verden. Mange skadelige sykdommer, inkludert lungekreft og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), er rapportert å være relatert til sigarettrøyking1,2. Sigarettrøyking øker mottakeligheten for akutte mikrobielle infeksjoner iluftveiene 3,4,5. Videre viser monteringsbevis at sigarettrøyking forbedrer patogenesen av mange kroniske lidelser6,7,8. Sigarettrøyking kan for eksempel øke virus- eller bakterieinfeksjoner som forårsaker KOLS-eksacerbasjon9. Blant de bakterielle patogener som etiologisk bidrar til akutt forverring av KOLS, forårsaker et opportunistisk gram-negativt bacillus patogen, Pseudomonas aeruginosa, infeksjoner som korrelerer med dårlige prognoser og høyeredødelighet 10,11. KOLS-forverring forverrer sykdommen ved å akselerere patologisk progresjon. Det finnes ingen effektive behandlinger mot KOLS-eksacerbasjon bortsett fra antisymptomatisk styring12. KOLS-forverring fremmer pasientdødelighet, reduserer livskvaliteten og øker den økonomiske byrden på samfunnet13.
Luftveiene er et åpent system, kontinuerlig utsatt for ulike mikrobielle patogener tilstede eksternt. Opportunistiske bakterielle patogener oppdages vanligvis i de øvre luftveiene, men noen ganger observeres i de nedre luftveiene14,15. I dyremodeller P. aeruginosa kan detekters i alveolr sacs så snart som 1 time etter infeksjon16. Som en viktig forsvarsmekanisme eliminerer immunceller som makrofager eller nøytrofiler bakteriene i luftveiene. Lungeepitelceller, som den første fysiologiske barrieren, utfører en unik rolle i vertsforsvaret mot mikrobielle infeksjoner. Lungeepitelceller kan regulere mikrobiell invasjon, kolonisering eller replikering uavhengig av immunceller17. Noen molekyler som finnes i epitelceller, inkludert PPARg, utøver antibakterielle funksjoner, og regulerer dermed bakteriell kolonisering og replikering i lungeepitelceller18. Sigarettrøyking kan endre molekylene og svekke normal forsvarsfunksjon i lungeepitelceller19,20. Nyere studier rapporterte direkte eksponering av sigarettrøyk til lungeepitelceller ved hjelp av robotrøykeapparat21,22. Eksponering for røyk kan utføres på andre måter, men inkludert bruk av CSE. Fremstilling av CSE er en reproduserbar tilnærming med potensielle applikasjoner i andre celletyper, inkludert vaskulære endotelceller som indirekte utsettes for sigarettrøyk.
Denne rapporten beskriver en protokoll for å generere sigarettrøyk ekstrakt for å endre bakteriell belastning i lunge epitelceller. CSE øker bakteriebelastningen av P. aeruginosa, og det kan bidra til tilbakefall av bakterielle infeksjoner vanligvis sett i KOLS-forverring. En konvensjonell metode brukes til fremstilling av CSE. Lungeepitelceller, på deres eksponentielle vekststadium, behandles med 4% CSE i 3 timer. Alternativt kan monolayer-kultiverte lungeepitelceller bli direkte utsatt for sigarettrøyk i et luftvæskegrensesnitt. CSE-behandlede celler blir deretter utfordret med Pseudomonas ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 10. Bakteriene spres med en bestemt ristingshastighet for å sikre at morfologien til deres flagella forblir intakt for å beholde sin fulle invasive kapasitet. Gentamycin er ansatt for å drepe bakteriene som er igjen i kulturmediet, og reduserer dermed den potensielle forurensningen under den påfølgende fastsettelsen av bakteriebelastningen. Protokollen bruker også GFP-merket Pseudomonas, som har blitt brukt som et kraftig verktøy i å studere Pseudomonas infeksjon i ulike modeller. En representativ stamme er P. fluorescens Migula23. Graden av infeksjon eller bakteriell belastning etter CSE-behandling bestemmes på tre måter: drop plate-metoden med kolonitelling, kvantitativ PCR ved hjelp av Pseudomonas 16S rRNA-spesifikke primere, eller strømningscytometri i celler infisert med fluorescerende Pseudomonas. Denne protokollen er en enkel og reproduserbar tilnærming for å studere effekten av sigarettrøyk på bakterielle infeksjoner i lungeepitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell invasjon i lungeepitelceller er et avgjørende skritt i patogenesen av bakterielle infeksjoner. Prosessen med bakteriell invasjon i cellene kan brytes ned i følgende tre trinn: Først kontakter bakteriene og holder seg til overflaten av epitelcellen ved hjelp av deres flagella. For det andre gjennomgår bakteriene enten internalisering eller trenger inn i cellulær membran. Til slutt replikerer og koloniserer bakteriene cellene hvis de klarer å unnslippe cellulæreforsvarsmekanismer 25</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Institutes of Health R01 tilskudd HL125435 og HL142997 (til CZ).
Materials
| 50mL syringe | BD Biosciences | ||
| airway epithelial cell basal medium | ATCC | PCS-300-030 | |
| Bacteria shaker | ThermoFisher Scientific | ||
| bronchial epithelial cell growth kit | ATCC | PCS-300-040 | |
| Cell Counter | Bio-Rad | ||
| CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | ||
| High-Capacity RNA-to-DNA KIT | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES medium | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| human BEAS-2B cells | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| human primary small airway epithelial cells | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Nikkon confocal microscope | Nikkon | ||
| OD reader | USA Scientific | ||
| PCR primers | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Research-grade cigarettes (3R4F) | University of Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Soy Broth | BD Biosciences |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
- Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
- Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
- Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
- Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
- Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
- Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
- Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
- Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
- Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
- Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
- Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, 21-30 (2016).
- Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), 286-291 (2000).
- Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
- Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
- Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
- Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
- Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
- Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784 (2013).
- Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
- Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
- Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
- Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
- Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26 (2009).
- Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
- Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588 (2018).
- Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology – Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
- Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
- Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125 (2018).
- Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
- Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
- Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
- Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
