एक स्वचालित फ्रीजर मिल में क्रायोग्रिंडिंग द्वारा सेल अर्क की तैयारी
Summary
हम एक क्रायोजेनिक फ्रीजर मिल का उपयोग करके खमीर या अन्य कोशिकाओं से पूरे सेल अर्क की तैयारी के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं जो प्रोटीन के क्षरण और विकृति को कम करता है। सेल अर्क कार्यात्मक प्रोटीन परिसरों, प्रोटेओमिक विश्लेषण, सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययन और लैबिल प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने के शुद्धिकरण के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
आनुवंशिक हेरफेर की आसानी और नवोदित खमीर सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में यूकेरियोटिक सेलुलर मशीनरी के मजबूत विकासवादी संरक्षण ने इसे एक पूर्व प्रख्यात आनुवंशिक मॉडल जीव बना दिया है। हालांकि, चूंकि कुशल प्रोटीन अलगाव कोशिकाओं के इष्टतम व्यवधान पर निर्भर करता है, इसलिए सेलुलर प्रोटीन के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए खमीर का उपयोग इसकी सेल दीवार से बाधित होता है जो एंजाइमेटिक रूप से पचाने के लिए महंगा होता है (लिटिकेस या ज़िमोलीज़ का उपयोग करके), और यांत्रिक रूप से बाधित करना मुश्किल (पारंपरिक बीड बीटर, एक फ्रांसीसी प्रेस या कॉफी ग्राइंडर का उपयोग करना) नमूनों के हीटिंग के कारण बिना, जो बदले में प्रोटीन डिजन्चर और गिरावट का कारण बनता है। हालांकि तरल नाइट्रोजन (एलएन2)के तहत खमीर कोशिकाओं के मैनुअल पीसने एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर नमूनों के ओवरहीटिंग से बचा जाता है, यह श्रम गहन है और ऑपरेटरों के बीच सेल लाइसिस में परिवर्तनशीलता के अधीन है । कई वर्षों के लिए, हम सफलतापूर्वक एक स्वचालित फ्रीजर मिल में कोशिकाओं के cryogrinding का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता खमीर अर्क तैयार किया गया है । एलएन2 के उपयोग के साथ हासिल -196 डिग्री सेल्सियस का तापमान जैविक सामग्री को प्रोटीज और न्यूक्लियस द्वारा गिरावट से बचाता है, जिससे बरकरार प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मैक्रोमॉलिक्यूल्स की प्राप्ति होती है। यहां हम नवोदित खमीर कोशिकाओं के लिए विस्तार से इस तकनीक का वर्णन करते हैं जिसमें पहले एलएन2 में अपनी ड्रॉपवाइज अतिरिक्त के माध्यम से लाइसिस बफर में कोशिकाओं के निलंबन को ठंडा करना शामिल है ताकि “पॉपकॉर्न” के रूप में जानी जाने वाली कोशिकाओं की जमे हुए बूंदों को उत्पन्न किया जा सके। इस पॉपकॉर्न तो एक फ्रीजर मिल में एलएन 2 के तहत pulverized है एक जमेहुए “पाउडर” निकालने जो धीरे से गल गया है और अघुलनशील मलबे को दूर करने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा स्पष्ट उत्पन्न करते हैं । परिणामस्वरूप अर्क डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं, जैसे प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण, प्रोटेओमिक विश्लेषण, या सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययन। यह तकनीक विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों, पौधों और पशु ऊतकों, कोरल सहित समुद्री नमूनों के साथ-साथ फोरेंसिक और पर्माफ्रॉस्ट जीवाश्म नमूनों से डीएनए/आरएनए को अलग-थलग करने से सेल निकालने की तैयारी के लिए व्यापक रूप से लागू होती है ।
Introduction
खमीर प्रोटीन अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव है, क्योंकि यह एक सरल यूकेरियोटिक जीव है जिसमें शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध आनुवंशिक और जैव रासायनिक उपकरणों की बहुतायत है1। उनकी मजबूत कोशिका दीवार के कारण, शोधकर्ताओं का सामना करने वाली एक चुनौती सेलुलर सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक lysing में है । खमीर कोशिकाओं के व्यवधान के माध्यम से प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीके उपलब्ध हैं जिनमें एंजाइमेटिक लाइसिस (zymolyase)2,3,रासायनिक लाइसिस4,फ्रीज-गलद्वाराशारीरिक रूप से लाइसिस, दबाव आधारित (फ्रेंच प्रेस)6,7,मैकेनिकल (ग्लास मोतियों, कॉफी ग्राइंडर)8,9,सोनीशन आधारित10 औरक्रायोजेनिक2,11शामिल हैं। नियोजित तकनीक के आधार पर सेल लाइसिस और प्रोटीन यील्ड की दक्षता काफी भिन्न हो सकती है, इस प्रकार लाइसेट के लिए वांछित डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए अंतिम परिणाम या उपयुक्तता को प्रभावित करती है। अस्थिर प्रोटीन का अध्ययन करते समय, क्षणभंगुर पोस्टट्रानलेशनल संशोधन होते हैं, या तापमान संवेदनशील होते हैं, विशेष रूप से एक विधि का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो तैयारी के दौरान नमूना हानि या गिरावट को कम करेगा।
| तैयारी तकनीक निकालें | विवरण | लाभ | नुकसान | डाउनस्ट्रीम विश्लेषण | हवाला |
| फ्रेंच प्रेस: ज़िमोलिज़ का उपयोग करके एंजाइमेटिक प्रीट्रीटमेंट के साथ उच्च दबाव वाले समरूप (उर्फ माइक्रोफ्लुइडाइजर) | Zymolyase-20T, एक माइक्रोफ्लुइडाइजर उच्च दबाव समरूप। बाधित एक हवा संचालित, उच्च दबाव पंप (अनुपात 1:250; आवश्यक हवा दबाव 0.6-एल MPa) और एक अतिरिक्त वापस दबाव इकाई के साथ एक विशेष व्यवधान कक्ष के होते हैं । प्रसंस्करण के लिए 20 एमएल का न्यूनतम नमूना आकार आवश्यक है। | संयुक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त अंतिम कुल व्यवधान 95 एमपीए के दबाव में 4 पास के साथ 100% से संपर्क किया, जबकि 95 एमपीए पर 4 पास के साथ केवल 32% व्यवधान की तुलना में ज़ाइमोलिज के बिना केवल समरूपता का उपयोग किया गया। | छोटे पैमाने पर आवेदनों के लिए उपयुक्त नहीं है। एंजाइम बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए महंगे हो सकते हैं। | प्रोटीन शुद्धि | 6 |
| मनका डिब्बा: Zymolyase इलाज कोशिकाओं को एक fastprep साधन में कांच के मोतियों के साथ lysed | मोटे तौर पर ठंड, सूखी, एसिड से धोया 0.5 मिमी कांच मोती की एक समान मात्रा लाइसिस बफर में सेल गोली की एक दी गई मात्रा में जोड़ा जाता है और कोशिकाओं को जोरदार मैनुअल आंदोलन द्वारा बाधित कर रहे हैं। | यह विशेष रूप से उपयोगी है जब प्रोटीन शुद्धिकरण के बजाय परख प्रयोजनों के लिए कई अलग अलग छोटे खमीर संस्कृतियों से अर्क बनाने । | ग्लास मनका प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन का कठोरता से इलाज किया जाता है जिससे व्यापक फोमिंग होती है जिससे प्रोटीन डेनैचुरेशन होता है। सेल टूटना की मात्रा भिन्न होती है, जबकि प्रोटियोलिसिस के साथ-साथ प्रोटीन के संशोधन के परिणामस्वरूप यांत्रिक टूटना के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के अर्क को गर्म किया जा सकता है। | ज्यादातर डीएनए और आरएनए विश्लेषण करता है, लेकिन पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ या उसके बिना जेल इलेक्ट्रोफेओरेसिस को विकृत करके प्रोटीन विश्लेषण भी करता है। | 8 |
| Zymolyase उपचार के बाद लाइसिस द्वारा ओस्मोटिक शॉक और Dounce समरूपता के संयोजन का उपयोग कर | कोशिका दीवारों के एंजाइमेटिक पाचन के बाद, एक डोनेस होमोजेनाइजर में एक तंग फिटिंग मूसल (निकासी 1 से 3 माइक्रोन) के 15 से 20 स्ट्रोक के साथ गोलाकारों को lysed किया जाता है। | BJ926 या EJ101 जैसे प्रोटीज़-कमी वाले उपभेदों का उपयोग करने के लिए लाभप्रद। यह खमीर कोशिकाओं को तोड़ने का सबसे सज्जन तरीका है और इसलिए यह उन अर्कों को तैयार करने के लिए सबसे उपयुक्त है जो जटिल एंजाइमेटिक कार्यों (जैसे, अनुवाद, प्रतिलेखन, डीएनए प्रतिकृति) को पूरा कर सकते हैं और जिसमें मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाओं (जैसे, राइबोसोम्स, स्प्लिससोम) की अखंडता को बनाए रखा जाना चाहिए। यह अक्षुण्ण नाभिक को अलग करने के लिए भी उपयोगी है जिसका उपयोग क्रोमेटिन अध्ययन (ब्लूम एंड कार्बन, 1 9 82) या परमाणु प्रोटीन अर्क (ल्यू और कोर्नबर्ग, 1 9 87) के लिए किया जा सकता है। | स्पेरोप्लास्ट लाइसिस प्रक्रिया के प्रमुख नुकसान यह हैं कि यह अपेक्षाकृत थकाऊ और महंगा है, विशेष रूप से बड़े पैमाने पर तैयारी (>10 लीटर) के लिए, और लंबे समय तक इनक्यूबेशन अवधि प्रोटियोलिसिस या प्रोटीन संशोधन का कारण बन सकती है। क्रोमेटिन की तैयारी के लिए, वे अंतर अपकेंद्रित्र (न्यूकोसोम सीढ़ी अखंडता के आधार पर) द्वारा उत्पादित लोगों की तुलना में अलग या कम गुणवत्ता के प्रतीत होते हैं। | क्रोमेटिन अध्ययन के लिए अक्षुण्ण नाभिक को अलग करना, ऐसे अर्क जो जटिल एंजाइमैटिक कार्यों को पूरा कर सकते हैं, अर्क की अखंडता की आवश्यकता होती है मैक्रोमॉलिकुलर संरचनाएं, परमाणु प्रोटीन अर्क। |
2 |
| मोर्टार/मूसल या ब्लेंडर का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में पीसकर फ्लैश फ्रोजन कोशिकाओं का सेल व्यवधान | कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में तुरंत जमे हुए हैं और फिर मूसल का उपयोग करके मोर्टार में मैन्युअल रूप से पीसकर, या तरल नाइट्रोजन की उपस्थिति में वारिंग ब्लेंडर का उपयोग करके lysed किया जाता है। | प्रोटोकॉल त्वरित और आसान है। यह बहुत बड़ी संस्कृतियों सहित खमीर कोशिकाओं की अलग-अलग मात्रा को समायोजित कर सकता है। इसका मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाओं को सक्रिय रूप से बढ़ते राज्य से तरल नाइट्रोजन (−196 डिग्री सेल्सियस) में तुरंत लिया जाता है, जो प्रोटीज और नाभिक जैसी डिग्रेडिव एंजाइम गतिविधियों को कम करता है और साथ ही प्रोटीन (जैसे, फॉस्फेट और किनेस) को संशोधित करने वाली गतिविधियों को कम करता है। यह विशेष रूप से बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एक खमीर संस्कृति से पूरे सेल अर्क बनाने के लिए अनुकूल है। | थोड़ा गन्दा और लापरवाह अन्वेषक के लिए संभावित रूप से खतरनाक। छोटे नमूने (यानी, 10 से 100 मिलीलीटर खमीर संस्कृतियों) आसानी से संसाधित नहीं किए जाते हैं क्योंकि ब्लेंडर में प्रभावी रूप से फ्रैक्चर करने के लिए जमे हुए सेल झुरमुटों का पर्याप्त द्रव्यमान नहीं होता है। यह व्यक्तिगत नमूनों को संसाधित करने और उपयोगों के बीच उपकरणों को साफ करने के लिए समय लेने वाली है। | बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एक खमीर संस्कृति से पूरे सेल अर्क। | 2 |
| ऑटोलिसिस, मनका मिल | पीएच 5.0, 50 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे, 200 आरपीएम / Ø 0.5 मिमी, 5 × 3 मिनट/3 मिनट | विशेष रूप से छोटे पैमाने पर निकालने की तैयारी के लिए त्वरित और कुशल लाइसिस | गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। मनका पिटाई उपकरण की आवश्यकता है। | छोटे पैमाने पर विश्लेषण। | 10 |
| ऑटोलिसिस, सोनिकेशन | पीएच 5.0, 50 डिग्री सेल्सियस, 24 घंटे, 200 आरपीएम, 4 × 5 मिनट/2 मिनट, दाल 80%, बिजली 80% | सोनीशन उपकरण आमतौर पर अधिकांश संस्थानों में उपलब्ध है। | गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। सोनीशन उपकरण की आवश्यकता है। स्लो लाइसिस में 24 घंटे से ज्यादा का समय लग सकता है। | खमीर सेल दीवार की तैयारी। | |
| उबलते और फ्रीज-गल प्रक्रिया | कोई विशेष उपकरण एक मानक फ्रीजर और एक हीटिंग ब्लॉक या गर्म पानी स्नान के अलावा अंय की जरूरत है । | कुशल, प्रजनन योग्य, सरल और सस्ती। | गर्मी पैदा करने से मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विकृति और क्षरण होता है। | पीसीआर द्वारा डीएनए विश्लेषण। | 5 |
तालिका 1: खमीर अर्क की तैयारी के लिए उपलब्ध तरीकों की तुलना।
क्रायोग्रिन्डिंग (उर्फ क्रायोजेनिक पीस/क्रायोजेनिक मिलिंग) आमतौर पर मात्रात्मक या गुणात्मक विश्लेषण के लिए विश्वसनीय तरीके से तापमान संवेदनशील नमूनों से न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन या रसायनों को पुनः प्राप्त करने के लिए नियोजित किया जाता है । इसका उपयोग जैव प्रौद्योगिकी, विष विज्ञान, फोरेंसिक विज्ञान12, 13,पर्यावरण विज्ञान, पादप जीव विज्ञान14 और खाद्य विज्ञान सहित विविध क्षेत्रों में कई अनुप्रयोगों के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। अक्षुण्ण जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स का अलगाव आमतौर पर तापमान पर गंभीर रूप से निर्भर करता है। बेहद कम तापमान यह सुनिश्चित करते हैं कि प्रोटीज और न्यूक्लियस निष्क्रिय रहते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बाद के विश्लेषणों के लिए बरकरार प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मैक्रोमॉलिक्यूल्स का विश्वसनीय अलगाव होता है। दरअसल, एक फ्रीजर मिल आम तौर पर -196 डिग्री सेल्सियस (एलएन2के उबलते बिंदु) के एक नमूना तापमान रखता है, इस प्रकार डीएनए/आरएनए या प्रोटीन विकृति और गिरावट को कम करने ।
फ्रीजर मिल एक विद्युत चुम्बकीय पीसने वाले कक्ष को नियोजित करती है जो तेजी से एक ठोस धातु बार या सिलेंडर को एक शीशी के भीतर आगे और पीछे ले जाती है जिसमें नमूना होता है ताकि स्टेनलेस स्टील एंड प्लग के बीच स्पंदित किया जा सके। उपकरण पीसने वाले कक्ष के भीतर एक चुंबकीय क्षेत्र बनाता है और तेजी से उलट जाता है। जैसे ही चुंबकीय क्षेत्र आगे-पीछे शिफ्ट होता है, चुंबक प्लग के खिलाफ नमूने को कुचल देता है इस प्रकार ‘क्रायोग्र्रिंडिंग’ और पॉपकॉर्न के स्पंदन को प्राप्त करता है। फ्रीजर मिल मोर्टार और मूसल की जगह लेता है और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ कई नमूनों (या 4 छोटे नमूनों तक) के अनुक्रमिक प्रसंस्करण की अनुमति देता है और मैनुअल पीसने से जुड़े उपयोगकर्ता-से-उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता से बचता है। एक बार नमूनों की कार्रवाई कर रहे हैं, सेल अर्क डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
खमीर से देशी प्रोटीन का अध्ययन करने की एक सीमा उनके कठिन सेल दीवार के कारण खमीर कोशिकाओं की अक्षम लाइसिस है। हालांकि कई तरीकों को विकसित किया गया है, हमारे हाथों में सबसे सुसंगत और कुशल विधि खमीर कोशिका…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
गुंजन लैब में रिसर्च को नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ, नेशनल साइंस फाउंडेशन और फ्लोरिडा डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ से फंडिंग का सपोर्ट मिल रहा है । हम तकनीकी सहायता के लिए स्नातक छात्र जॉन पार्कर का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
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