在自动冷冻机中冷冻处理细胞提取物的制备
Summary
我们描述了一种可靠的方法，使用低温冷冻机制备酵母或其他细胞的整细胞提取物，从而最大限度地减少蛋白质的降解和变性。细胞提取物适用于功能性蛋白质复合物的纯化、蛋白质组分析、共免疫沉淀研究和实验室蛋白修饰的检测。
Abstract
基因操纵的易用性以及真核细胞机械在萌芽酵母糖精中强大的进化 保护 ，使得它成为杰出的基因模型生物体。然而，由于有效的蛋白质分离取决于细胞的最佳干扰，因此，使用酵母对细胞蛋白进行生化分析受到细胞壁的阻碍，因为细胞壁酶（使用溶酶或酶）消化成本高昂，而且难以机械地（使用传统的珠子打手、法国压机或咖啡研磨机）进行分解，而不会导致样品加热，进而导致蛋白质变性和降解。虽然在液氮（LN 2）下对酵母细胞进行人工研磨（LN2）避免了样品过热，但经过人工密集，且受操作者之间细胞解法的变异性影响。多年来，我们已经成功地制备了高品质的酵母提取物，使用细胞在自动冷冻机中的冷冻。使用 LN2 可达到 -196 °C 的温度，可保护生物材料免受蛋白酶和核酸酶降解的影响，从而检索到完整的蛋白质、核酸和其他大分子。在这里，我们详细描述这种技术，为萌芽酵母细胞，其中涉及首先冻结细胞悬浮液在解解缓冲，通过其滴入LN2 产生冷冻滴细胞称为”爆米花”。然后，在冷冻机的LN2下粉碎 爆米花，产生冷冻的”粉状”提取物，通过离心缓慢解冻并澄清，以去除不溶性碎屑。所得提取物可用于下游应用，如蛋白质或核酸纯化、蛋白质细胞分析或联合免疫沉淀研究。该技术广泛适用于各种微生物、植物和动物组织、海洋标本（包括珊瑚）的细胞提取制备，以及从法医和永久rost化石标本中分离DNA/RNA。
Introduction
酵母是蛋白质研究的流行模型生物体，因为它是一个简单的真核生物，有大量的遗传和生化工具可供研究人员使用。由于其坚固的细胞壁，研究人员面临的一个挑战是有效地细胞，而不会损害细胞内容。不同的方法可用于通过破坏酵母细胞获得蛋白质提取物，其中包括酶溶酶（酶酶）2，3，化学溶解4，物理溶解通过冷冻解冻5，基于压力（法国压榨机）6，7，机械（玻璃珠，咖啡研磨机）8，9，基于声波为基础的10和低温2，11。细胞分解和蛋白质产量的效率可能因所采用的技术而有很大差异，从而影响最终结果或对解酶所需的下游应用的适用性。当研究不稳定的蛋白质，有转瞬即逝的后翻译，或对温度敏感，这是特别重要的，使用的方法，将尽量减少样品损失或降解在制备期间。
| 提取制备技术 | 细节 | 优势 | 缺点 | 下游分析 | 参考 |
| 法国媒体：高压均质器（又名微流体），使用酶酶进行酶预处理 | Zymolyase-20T，一种微流体高压均质器。干扰器包括一个空气驱动高压泵（比率为 1：250;所需气压 0.6-l MPa）和一个带附加背压单元的特殊干扰室。处理需要最小样品大小为 20 mL。 | 使用组合协议获得的最终总中断接近 100%，4 次传球压力为 95 MPa，相比之下，只有 32% 的中断，在 95 MPa 时获得的 4 次中断仅使用均质化，无需 Zymolyase。 | 不适合小规模应用。酶可以变得昂贵的大规模制剂。 | 蛋白质纯化 | 6 |
| 珠子打手：用玻璃珠在快速准备仪器中用玻璃珠的酶处理细胞 | 在解解缓冲液中，大约将相同体积的冷、干、酸洗的 0.5 mm 玻璃珠添加到给定体积的细胞颗粒中，并且细胞被剧烈的手动搅拌破坏。 | 当从许多不同的小酵母培养物中提取提取物用于测定目的，而不是蛋白质纯化时，它特别有用。 | 在玻璃珠过程中，蛋白质受到严厉处理，导致大量发泡，导致蛋白质变性。细胞破裂量变化，而蛋白质的蛋白质解和修饰可能是由于在机械破损期间加热高于4°C的提取物。 | 主要是DNA和RNA分析，但也蛋白质分析通过变性凝胶电磷，无论是有或没有西方印迹。 | 8 |
| 使用渗透性休克和 Dounce 均质化的组合进行齐莫解酶治疗，然后进行解解 | 在细胞壁的酶消化后，在Dounce均质器中用15至20次紧贴的纠缠（间隙1至3μm）来乳化。 | 有利于使用蛋白酶缺乏菌株，如BJ926或EJ101。这是打破酵母细胞的最温和的方法，因此它最适合制备可以执行复杂酶功能的提取物（如翻译、转录、DNA复制），其中必须保持大分子结构（如核糖体、拼接体）的完整性。它还可用于分离可用于染色质研究（Bloom和 Carbon，1982 年）或核蛋白提取物（Lue 和 Kornberg，1987 年）的完整核。 | 球状解解程序的主要缺点是，它相对乏味和昂贵，特别是对于大规模制剂（>10升），和较长的潜伏期可能导致蛋白解或蛋白质修饰。 对于染色质制剂，它们的质量似乎不同或低于微分离心（基于核体梯完整性）产生的质量。 | 分离完整的核用于染色质研究，可执行复杂酶函数的提取物，需要完整性的提取物 大分子结构，核蛋白提取物。 |
2 |
| 使用砂浆/聚剂在液氮中研磨，对闪冻细胞进行细胞破坏 | 细胞立即在液氮中冷冻，然后用砂浆中手动研磨，或在液氮存在的情况下使用沃林搅拌机进行搅拌。 | 该协议是快速和容易的。它可以容纳不同数量的酵母细胞，包括非常大的培养物。它的主要优点是细胞立即从积极生长状态取到液氮（+196°C），减少降解酶活性，如蛋白酶和核酸酶，以及改变蛋白质（如磷酸盐和激酶）的活动。它特别适合从单一酵母培养物中制造全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。 | 有点乱，对粗心的调查员有潜在危险。小样品（即10-100毫升酵母培养物）不容易加工，因为没有足够的冷冻细胞团在搅拌机中有效断裂。处理单个样品并在使用之间清洁设备非常耗时。 | 从单一酵母培养物中提取全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。 | 2 |
| 自动解，珠磨机 | pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm / Φ 0.5 毫米， 5 × 3 分钟/3 分钟 | 快速高效的解解，特别是用于小规模萃取制备 | 热生成导致大分子变性和退化。需要打珠设备。 | 小规模分析。 | 10 |
| 自动分析，声波化 | pH 5.0， 50 °C， 24 小时， 200 rpm， 4 × 5 分钟/2 分钟， 脉冲器 80%， 功率 80% | 声波设备通常在大多数机构中可用。 | 热生成导致大分子变性和退化。需要声波设备。慢解可能需要超过 24 小时。 | 酵母细胞壁制剂。 | |
| 煮沸和冷冻解冻过程 | 除标准冰柜、加热块或热水浴浴（其他设备）以外的不需要专用设备。 | 高效、可重复、简单且价格低廉。 | 热生成导致大分子变性和退化。 | 由 PCR 进行 DNA 分析。 | 5 |
表1：用于制备酵母提取物的方法的比较。
低温研磨（又名低温研磨/低温铣削）通常用于以可靠的方式从温度敏感样品中检索核酸、蛋白质或化学品，进行定量或定性分析。它已成功应用于生物技术、毒理学、法医学、12、13、环境科学、植物生物学14和食品科学等多个应用。分离完整的生物大分子通常严格取决于温度。极低的温度确保蛋白酶和核酸酶保持不活动状态，从而可靠地分离完整的蛋白质、核酸和其他大分子，以便随后进行分析。事实上，冷冻机通常保持-196°C的样品温度（LN2的沸点），从而最大限度地减少DNA/RNA或蛋白质变性和降解。
冷冻机采用电磁磨床，在装有样品的小瓶内快速移动实心金属棒或圆柱体，在不锈钢端塞之间粉碎。仪器在磨削室内产生并快速反转磁场。当磁场来回移动时，磁铁将样品压在插头上，从而实现爆米花的”冷冻”和粉碎。冷冻机取代了砂浆和砂浆，允许对多个样品（或同时最多 4 个较小的样品）进行连续处理，具有很高的可重复性，并避免了与手动磨削相关的用户对用户的变异性。处理样品后，细胞提取可用于各种下游应用。
Protocol
1. 酵母爆米花的制备 在0.5L的YPD培养木中生长酵母细胞，密度为1 x 107 细胞/mL。使用库尔特计数器或任何其他方法计算单元格。 在2，400克和4°C下进行10分钟的离心细胞。 用 500 mL 的冰冷除去 18 兆欧姆美尔 Q 水洗一次每个样品。 在 15 mL 的冰冷的乳酸缓冲液中重新消耗颗粒 [20 mM HEPES-KOH pH 7.5， 110 mM KCl， 0.1% Tween， 10% 甘油醇，新添加的还原剂 10 mM β-墨卡普托乙…
Representative Results
我们比较了酵母细胞解解的两种不同方法，即在4°C的玻璃珠铣削和-196°C的自动冷冻方法，以评估用这两种方法准备的细胞提取物的相对恢复蛋白。对于本研究，我们选择使用萌芽酵母菌株 YAG 1177 （MAT a lys2-810 leu2-3，-112 ura3-52 his3-200 trp1-1[am] ubi1-1：TRP1 ubi2-2：：ura3 ubi3-μub-2 ubi4-2：：LEU2 [pUB39] [pUB221]）16 携带高拷贝质粒，表达串联 HIS-MYC 标记的泛素 （HIS-M…
Discussion
研究酵母中原生蛋白质的一个限制是酵母细胞由于其坚固的细胞壁而低效的分解。虽然已经开发出几种方法，但我们手中最一致、最有效的方法是将酵母细胞的冷冻蛋白像爆米花一样冷冻。与其他溶菌方法相比，此方法允许可靠制备来自萌芽酵母的高质量全细胞提取物。代表性的结果表明，在4°C下采用珠铣削的酵母解化机械方法优于一种流行的机械方法（图3A和3B）。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gunjan实验室的研究得到了美国国家卫生研究院、国家科学基金会和佛罗里达州卫生部的资助。我们感谢本科生约翰·帕克的技术支持。
Materials
| 50 mL polycarbonate tubes with screw caps | Beckman | 357002 | Centrifuge tubes |
| BD Bacto Peptone | BD Biosiences | 211677 | Yeast YPD media component |
| BD Bacto Yeast Extract | BD Biosiences | 212750 | Yeast YPD media component |
| Beckman Avanti centrifuge | Beckman | B38624 | High speed centrifuge |
| Beckman JLA-9.1000 | Beckman | 366754 | Rotor |
| D-(+)-Dextrose Anhydrous | MP Biomedicals | 901521 | Yeast YPD media component |
| Eppendorf A-4-44 | Eppendorf | 22637461 | Swinging bucket rotor |
| Eppendorf refrigerated centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Refrigerated centrifuge |
| Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5150-1GA | Volume excluder and cryoprotectant |
| HEPES | FisherBiotech | BP310-100 | Buffer |
| HIS6 antibody | Novagen | 70796 | Antibody for HIS tag |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P9541-1KG | Salt for maintaining ionic strength |
| MG-132 | CALBIOCHEM | 474790 | Proteasome Inhibitor |
| Phosphatase inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32957 | Phosphatase inhibitor cocktail |
| Ponceau S | SIGMA | P7170-1L | Protein Stain |
| Protease inhibitor cocktail | ThermoFisher Scientific | A32963 | Protease inhibitor cocktail |
| Rotor JLA 25.500 | Beckman | JLA 25.500 | Rotor |
| Sodium Butyrate | EM Science | BX2165-1 | Histone Deacetylase Inhibitor |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S6521 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium Vanadate | MP Biomedicals | 159664 | Phosphatase Inhibitor |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | 13408-09-8 | Phosphatase Inhibitor |
| Spex Certiprep 6850 freezer mill | SPEX Sample Prep | 6850 | Freezer Mill |
| TALON Metal Affinity Resin | BD Biosiences | 635502 | For pulling down HIS tagged proteins |
| Tween 20 | VWR International | VW1521-07 | Non-ionic detergent |
| β-Mercaptoethanol | AMRESCO | M131-250ML | Reducing agent |
References
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Keywords: Yeast Cell LysisCryogrindingAutomated Freezer MillProtein ExtractionNative Protein IsolationMacromolecule ExtractionPhysical Lysis MethodsTemperature-sensitive LysisEnzymatic Lysis LimitationsChemical Lysis LimitationsFrench PressMortar And PestleBead Beater MillSonicationHeat GenerationProtein DenaturationProtein Degradation
Cite This Article
Phillips, E. O. N., Giovinazzi, S., Menz, S. L., Son, Y., Gunjan, A. Preparation of Cell Extracts by Cryogrinding in an Automated Freezer Mill. J. Vis. Exp. (167), e61164, doi:10.3791/61164 (2021).